補腎活血湯干預衰老大鼠退變椎間盤模型中經典WNT信號通路β—catenin蛋白含量的研究

謝芳 吳官保 姚紅艷 馮帥華 楊屆

〔摘要〕 目的 觀察補腎活血湯對衰老大鼠退變椎間盤組織形態結構及β-catenin蛋白含量的影響。方法 選取三月齡健康SD大鼠80只，雌雄各半，隨機分為空白組、假模型組、模型組、中藥低劑量組以及中藥高劑量組，每組16只，雌雄各半。除空白組和假模型組外，其余各組注射D-半乳糖建立大鼠衰老動物模型，空白對照組、假模型組與模型組每日生理鹽水灌胃，中藥低劑量組及中藥高劑量組補腎活血湯每日灌胃，持續12周。分別于造模后、灌胃4周后、灌胃8周后、灌胃12周后每組隨機抽取雌雄大鼠各2只處死取材，光鏡下觀察椎間盤組織形態學變化并運用蛋白質印跡法（Western Blot）檢測β-catenin蛋白表達差異。結果 與模型組比較，經補腎活血湯干預后，中藥低劑量組及中藥高劑量組大鼠椎間盤組織形態學評分降低（P<0.05），β-catenin蛋白表達水平降低（P<0.05）。結論 補腎活血湯能有效抑制經典Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白分子β-catenin蛋白的表達，從而起到延緩椎間盤退變的作用。

〔關鍵詞〕 補腎活血湯；腰椎間盤退變；β-catenin蛋白

〔中圖分類號〕R285.5；R681.5+3 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.011

Effects of Bushen Huoxue Decoction on β-catenin Protein Level of WNT Signal Pathway in Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Aging Model Rats

XIE Fang1， WU Guanbao1*， YAO Hongyan2， FENG Shuaihua1， YANG Jie1

（1. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China； 2. Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Bushen Huoxue decoction on the structural and histopathological changes and β-catenin protein in lumbar intervertebral disc degeneration aging model rats. Methods Eighty three-month old SD rats （male-female half and half） were randomly divided into blank control group， sham-model group， model group， TCM low-dose group and TCM high-dose group， 16 rats in each group. Except the blank group and sham-model group， the aging model rats in other groups were established by injecting D-galactose. The rats in blank control group，sham-model group and model group were daily given normal saline by gavage. TCM low-dose and high-dose groups were daily treated with Bushen Huoxue decoction for 12 weeks by gavage. Two male rats and two female rats in each group were randomly executed at after modelling， after 4 weeks of gavage， after 8 weeks of gavage and after 12 weeks of gavage， and samples were selected from dead rats. The histomorphological change of model group was observed by light microscope， and the expression of β-catenin protein was detected by Western Blot method. Results Compared with the model group， the histomorphology score in TCM low-dose and high-dose groups treated with Bushen Huoxue decoction decreased （P<0.05）， and the expression of β-catenin protein decreased （P<0.05）. Conclusion Buyang Huanwu decoction shows inhibition effect on the expression of key β-catenin protein in the classical Wnt/β-catenin signal pathway， and thus could relieve the degeneration of intervertebral disc.

〔Keywords〕 Bushen Huoxue decoction； lumbar intervertebral disc degeneration； β-catenin protein

腰椎退行性病變及腰椎間盤突出癥作為臨床常見病癥，給現代人們的生活造成的困擾正日漸加重。隨著現代社會的發展，人們生活習慣的改變，其發病日益趨向年輕化和嚴重化[1]。目前椎間盤的具體退變機制尚未明確，近年來對其退變信號通路調控機制的研究已成為一大熱點。Wnt信號轉導通路包含多種分支傳導信號通路，其中每一條亞通路都有其特定的作用。目前逐漸被研究人員所熟悉的主要是Wnt/β-catenin信號通路。研究表明[2]，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活能改變椎間盤組織細胞的內環境，促進軟骨終板、髓核及纖維環的退變，從而引起椎間盤結構的變形。本項目前期研究[3-4]證明：補腎活血湯在通過減少椎間盤組織中炎性因子的表達，減少炎性反應從而有效緩解椎間盤的退變。本文旨在通過觀察D-半乳糖致衰老大鼠椎間盤的退變情況，并檢測β-catenin蛋白在退變椎間盤治療前后的表達情況研究補腎活血湯對經典Wnt信號通路的影響，從另一個角度揭示補腎活血湯對于椎間盤退變的治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 三月齡SD大鼠（SPF級）80只，雌雄各半，體質量（236.40±54.28） g，生產單位：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004，動物合格證編號：43004700027559。

1.1.2 實驗試劑 D-半乳糖（批號：H15M8C30836）：上海源葉生物科技有限公司，純度99%；Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅：美國Sigma公司；HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG：美國Proteintech；RIPA裂解液：中國北京普利萊公司；蛋白酶抑制劑：德國Merck公司；蛋白磷酸酶抑制劑：瑞士Roche公司；SuperECL Plus超敏發光液：美國Thermo pierce公司；顯影液、定影液：中國WellBiology公司（以上試劑均由維爾生物科技有限公司統一采供并提供）。

1.1.3 補腎活血湯制備 按《傷科大成》中所載方劑補腎活血湯，以現在臨床常用藥物劑量為依準，處方組成：熟地黃15 g，杜仲10 g，枸杞子10 g，補骨脂15 g，菟絲子10 g，當歸尾10 g，沒藥10 g，山茱萸10 g，紅花6 g，獨活10 g，肉蓯蓉10 g，上述飲片均由湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科提供。浸泡、煎煮、去渣，分別濃縮至生藥含量約為0.58 g/mL及1.66 g/mL 2種劑量（分別相當于臨床等效劑量的1、2倍），封瓶備用。

1.1.4 主要儀器 TS-92型搖床（江蘇其林貝爾有限公司）；TGL-18R型臺式冷凍離心機（深圳黑馬有限公司）；164-5050型電泳儀（美國Bio-rad公司）；DYCZ-24EN型電泳槽（北京六一有限公司）；DYCZ-40A型轉膜儀（北京六一有限公司）；QL-901型旋渦混合器（江蘇其林貝爾有限公司）（以上均由湖南省中醫藥研究院附屬醫院病理科提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 80只大鼠采用隨機數字表分為5組，A組為空白組16只，B組為假模型組16只（注射生理鹽水），C組為衰老模型組（D-半乳糖干預）16只，D組為中藥低劑量組16只、E組為中藥高劑量組16只（均為補腎活血湯干預）。

1.2.2 動物造模 實驗動物造模方法借鑒邱柏程等[5]衰老大鼠模型造模方法：A組大鼠不予以處理用作空白對照，C組、D組、E組大鼠分別予以10%D-半乳糖溶液0.125 g/（kg·d）腹腔注射，B組大鼠予以等量生理鹽水腹腔注射，藥物注射造模時間為30 d，造模期間每只大鼠每日腹腔注射前，先稱量質量，根據大鼠質量變化調整注射劑量。造模后各組隨機選取雌雄大鼠各2只，處死后取出腰椎間盤組織，制作石蠟標本，在光鏡下觀察各組大鼠椎間盤形態。按Miyamoto等[6]分級標準將椎間盤組織在光鏡下的觀察結果分為1-5級，分別規定為1、2、3、4、5分，椎間盤形態達3級或以上為造模成功。

1.2.3 干預方法 大鼠造模成功后，根據人與動物體表面積換算公式，計算出大鼠給藥劑量。A、B、C組均予以生理鹽水灌胃，D組、E組分別以5.8 g/kg、16.6 g/kg灌胃予以補腎活血湯，每天1次，灌胃期間每周稱1次大鼠質量，根據質量變化調整藥物灌胃劑量，持續12周。

1.2.4 標本采集 實驗過程中分別于造模后、灌胃4周后、灌胃8周后、灌胃12周后于各組隨機抽取雌雄大鼠各2只，處死后取出腰椎間盤組織，一部分制作成蠟塊標本，于光學顯微鏡下觀察椎間盤形態結構，另一部分取出的椎間組織盤測定質量后冷凍，用于測定β-catenin 蛋白的含量。

1.2.5 光鏡下觀察椎間盤形態組織變化及評分 分別于造模后、灌胃第4周、第8周、第12周時取各組玻片標本于光鏡下觀察椎間盤組織的形態組織變化，依據Wang等[7]制定的椎間盤評分標準來評價：以光鏡下大鼠椎間盤纖維環、髓核、骨贅3個觀察因子（每個觀察因子按退變情況從低到高分別計為0～3分）為標準計分，最后根據總分評價椎間盤的退變情況。

1.2.6 β-catenin蛋白含量測定 采用Western blot方法，根據BCA方法測定β-catenin蛋白濃度。將樣品制備后，通過BCA蛋白定量試劑盒（WellBiology），測定β-catenin濃度范圍（操作按試劑盒指示說明依次操作），作為Western blot的參考。電泳分離蛋白，轉膜110 min，25 ℃用5%脫脂奶粉封閉1 h。稀釋一抗，4 ℃過夜，β-catenin稀釋比例為1∶1 000，β-actin稀釋比例為1∶4 000，HRP標識的二抗以1：3 000的比例混合稀釋，室溫下孵育45～60 min。ECL化學發光液（Thermo）與膜一起孵育3 min后，與X膠片在暗盒內片曝光數秒至數分鐘；顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，并用Quantity one專業灰度分析軟件進行分析，以β-catenin蛋白條帶灰度與β-actin蛋白條帶灰度的比值表示β-catenin蛋白的表達水平。

1.3 統計方法

實驗數據用SPSS 17.0統計軟件進行分析，所有數據均采用“x±s”表示。使用單因素的方差分析對比各組間的均數，如果滿足正態性和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析的最小二乘法（LSD法），行多組間均數的兩兩比較，方差不齊時，采用t檢驗。P<0.05時表示各組數據差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下各組大鼠椎間盤組織形態變化

造模后，A、B組纖維環及髓核結構完整，排列規律；C、D、E組纖維環膠原纖維層及軟骨排列雜亂，髓核皺縮（見圖1）。灌胃4周后，A、B組椎間盤組織無明顯變化；C組纖維層變薄，軟骨細胞增多；D、E組纖維層變薄，無軟骨細胞增生。灌胃8周后，A、B組膠原纖維及軟骨細胞分層排列，髓核稍有脫水；C組纖維環出現裂隙，軟骨層鈣鹽沉積；D組纖維層逐漸被軟骨細胞取代；E組纖維層維持排列。灌胃12周后，A、B組纖維層變薄，不規則排列；C組原纖維層骨化物生成，膠原纖維及髓核基本消失；D組鈣鹽沉積；E組纖維環破裂（見圖2）。

2.2 各組大鼠椎間盤形態組織學評分

造模后，與空白組、假模型組對比，所有D-半乳糖致衰老大鼠椎間盤形態組織學評分均增加，差異具有統計學意義（P<0.05），表明衰老大鼠椎間盤退變，提示造模成功；灌胃4、8、12周后，與模型組比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組大鼠椎間盤形態組織學評分降低，差異具有統計學意義（P<0.05），提示補腎活血湯能有效延緩大鼠椎間盤的退變。結果見表1。

2.3 各組大鼠β-catenin蛋白相對表達水平對比

造模后：與空白組對比，假模型組β-catenin蛋白表達水平無明顯差異；與空白組對比，模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組中β-catenin蛋白表達水平明顯增高，差異具有統計學意義（P<0.05），說明造模成功，即D-半乳糖能加速大鼠椎間盤退變。灌胃4、8、12周后：與空白組對比，模型組中β-catenin蛋白表達水平增高，差異具有統計學意義（P<0.05），說明D-半乳糖能加速大鼠椎間盤退變；與模型組對比，中藥低劑量組、中藥高劑量組中β-catenin蛋白表達水平降低，差異具有統計學意義（P<0.05），說明補腎活血湯能減少大鼠椎間盤內β-catenin蛋白的含量，即能延緩大鼠椎間盤的退變；與中藥低劑量組對比，中藥高劑量組β-catenin蛋白表達水平降低，差異具有統計學意義（P<0.05），說明高濃度補腎活血湯對大鼠椎間盤退變的治療效果更好，進一步證明補腎活血湯對椎間盤退變的治療意義。見表2、圖3-圖7。

3 討論

Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號通路中的一個重要分支，是由β-catenin蛋白介導的，對細胞的增殖代謝及生長發育有著重要意義的調控系統。Wnt/β-catenin信號通路由Wnt配體，跨膜受體，β-catenin蛋白及轉錄因子等組成。在靜息狀態下，β-catenin蛋白被細胞質中的降解復合體不斷的磷酸化，處于低濃度表達水平；Wnt配體與跨膜受體結合后，將β-catenin蛋白從降解復合體中游離出來，使其在細胞內的表達水平增高，最終β-catenin蛋白進入細胞核，并激活下游的轉錄因子。通常認為β-catenin蛋白表達水平的增高是Wnt/β-catenin信號通路激活的標志。目前較多的研究發現Wnt/β-catenin信號通路能夠調控軟骨細胞的生存與代謝[8-10]。椎間盤組織作為一個類軟骨組織其軟骨終板的退變與鈣化正是椎間盤退變的表現形式之一，所以Wnt/β-catenin信號通路的激活與椎間盤的退化有著必然的聯系。Hiyama等[11]通過激活Wnt/β-catenin信號通路，檢測到椎間盤細胞基質金屬蛋白酶的表達水平增高。因MMPs能夠降解椎間盤細胞外基質中的膠原纖維及蛋白多糖從而加快椎間盤的退變速度，提示Wnt/β-catenin信號通路可能通過調控基質金屬蛋白酶的表達水平，從而參與到椎間盤的退變過程之中。

在我國傳統醫學的認知中椎間盤退變性疾病屬于“痹癥”的范疇，常因風邪夾濕氣或寒邪侵襲人體所致。《靈樞·百病始生》記載：“風雨寒熱，不得虛，邪不能獨傷人。”高齡人群因為年高體衰，肝腎不足，致使肝腎之精不能濡養筋骨，從而出現腰部疼痛，下肢酸軟等癥狀。腰為腎之府，腎為先天之本，藏精主骨，為一身陰陽之根本；肝在體合筋，肝血充足則筋肉強勁有力，肢體活動自如。肝腎虧虛，不能滋養筋骨，筋骨萎弱，氣行不暢，邪氣入侵腰部，致使腰部長期疼痛不愈。所以本病之本為肝腎虧虛，其標為風寒濕邪、血瘀氣滯、痰飲等[12]。趙永華等[13]認為腰椎間盤突出的發病“腎虛”為本，“瘀血”為標，運用補腎活血針法能有效的緩解腰部疼痛。現代研究發現[14]補腎活血湯能促進骨髓間充質干細胞的增值，并能降低炎性因子的表達。補腎活血湯為我國清代醫家趙濂所著《傷科大成》所記載的經方，方中熟地黃、山茱萸為君藥，益腎填精；杜仲、枸杞、肉蓯蓉、補骨脂、菟絲子為臣藥，溫補元陽，使筋骨堅強；當歸尾、沒藥、紅花、獨活為佐藥，活血通絡，祛風除濕。全方配伍嚴謹，以補腎溫陽為主，兼以活血祛濕，扶正祛邪，標本兼顧。

本次實驗通過檢測D-半乳糖連續注射后的大鼠椎間盤組織中的β-catenin水平，發現模型組中β-catenin蛋白的表達水平明顯較空白組高（P<0.05），證明Wnt/β-catenin信號通路確實參與到椎間盤的退變過程中，提示Wnt/β-catenin的異常激活能加速椎間盤的退變。通過分別檢測補腎活血湯灌胃4、8、12周后大鼠椎間盤組織中β-catenin表達水平，發現中藥低劑量組與中藥組高劑量組中β-catenin蛋白的表達水平明顯較模型組低（P<0.05），表明經過補腎活血湯干預，β-catenin蛋白在椎間盤組織細胞中的表達水平下調，補腎活血湯能夠通過調控β-catenin蛋白的表達從而起到延緩椎間盤退變的治療效果。綜上所述，補腎活血湯能有效地降低退變椎間盤中β-catenin蛋白的表達，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，能有效地延緩椎間盤的退變。

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