整合素αvβ3介導EPCs修復損傷血管內皮及補陽還五湯的干預作用

賀冰 劉曉丹 李亮 李平 張偉

〔摘要〕 目的 探討補陽還五湯促進EPCs修復損傷血管內皮的作用，從歸巢環節闡釋其作用機制，為中醫藥防治心腦血管疾病提供參考。方法 以補陽還五湯灌胃及尾靜脈輸注EPCs作用于內皮損傷的模型大鼠，從血管內皮形態、EPCs歸巢等方面評價內皮損傷修復情況，從整合素αvβ3和αvβ5介導的SDF-1/CXCR-4信號通路了解該方促進EPCs歸巢的機制。結果 與單用EPC組（E組）和單用藥物組（b組）比較，補陽還五湯聯合EPC組（B組）αvβ3表達顯著增加（P<0.05），血管SDF-1表達顯著增高（P<0.01）。結論 補陽還五湯能促進EPC修復損傷的血管內皮，其作用機制可能與該方能上調整合素αvβ3介導的SDF-1信號通路相關蛋白，促進EPCs的歸巢有關。

〔關鍵詞〕 整合素αvβ3；整合素αvβ5；內皮祖細胞；補陽還五湯；歸巢

〔中圖分類號〕R289 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.008

Intervention Effect of Buyang Huanwu Decoction on Integrin αvβ3-Mediated EPCs in Repairing Damaged Vascular Endothelium

HE Bing1， LIU Xiaodan2， LI Liang3， LI Ping2， ZHANG Wei4*

（1. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China； 2. Hunan Key Laboratory of TCM Prevention and Treatment of Cardiovascnlar and Cerebrovascular Diseases， Changsha， Hunan 410005， China； 3. College of Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Chinsese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China；

4. College of Integrated Chinese and Western medicines， Hunan University of Chinsese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the role of Buyang Huanwu decoction （BYHWD） in promoting endothelial progenitor cell （EPC）-induced recovery of injuried endothelial cells， and explain the mechanism from EPCs homing. Methods The endothelial injuried rats were given gavage with BYHWD and vena caudalis injection of EPC. The repaired situation of injuried endothelium was observed. The effect of BYHWD on EPC homing was analyzed from integrin αvβ3 and integrin αvβ5-mediated SDF-1/CXCR-4 signaling pathway. Results Compared with group EPC （group E） and BYHED group （group b）， the protein expression of vascular αvβ3 in BYHWD combined with EPC （group B） increased more significantly （P<0.05）， vascular SDF-1 expression increased significantly （P<0.01）. Conclusion BYHED could promote EPC repairing damaged endothelium， the mechanism may be related to promote EPCs homing through upregulating αvβ3-mediated SDF-1signaling pathway.

〔Keywords〕 integrin αvβ3； integrin αvβ5； Endothelial progenitor cell； Buyang Huanwu decoction； homing

血管內皮損傷是動脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病的始動因素和共同的病理基礎[1]。因而，及時有效地修復損傷的血管內皮是防治心腦血管疾病發生發展的有效手段和重要策略。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是修復血管內皮的種子細胞[2]，由于種子細胞的生存依賴于快速的血管化[3]，因而促進EPCs的快速準確的歸巢具有重要的科學意義。整合素的主要功能是黏附和信號傳導，介導細胞、基質之間的相互作用，參與調節細胞的黏附、增殖、分化、遷移、凋亡、血管發生等[4-5]，基質細胞衍生因子-1（the stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其唯一受體趨化因子受體-4（CXC chemokine receptor 4，CXCR-4）軸在EPCs的歸巢、動員和分化中發揮著關鍵作用[6]。因此整合素與SDF-1/CXCR-4軸是否為調控EPCs歸巢并發揮修復作用的關鍵環節值得進一步探討。中醫藥在防治心腦血管疾病方面積累了大量的經驗，補陽還五湯（BYHWD）是中醫益氣活血法的代表方劑，本團隊已有研究表明該方能促進內皮損傷的修復[7-9]，其機制與促進EPCs的歸巢有關，但具體的作用環節和機制尚不清楚。因此，從整合素促進歸巢環節加以研究補陽還五湯對EPCs修復受損內皮的調控機制，對于該方的合理運用具有重要意義，亦為中醫藥防治心腦血管疾病提供了新靶點、新參考。

1 材料

1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠，體質量180～200 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：scxk（湘）2011-0003。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗鼠多克隆SDF-1抗體 （R&D Systems，Inc.， USA），兔抗鼠單克隆CXCR-4抗體（abcam， USA），兔抗鼠多克隆αvβ3、αvβ5抗體（Boster， WuHan），羊抗免二抗（Boster，WuHan）等。DF5000B Leica熒光顯微鏡、Leica CM 1850冰凍切片機（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）；DYY-6C電泳儀、DYCP-40D迷你轉印電泳儀（槽）（北京六一，CHN），圖像分析軟件IPP6.0等。

2 方法

2.1 EPCs的培養、鑒定和標記

SD大鼠適應性喂養3 d后頸椎脫臼處死，采用改良密度梯度離心的方法獲取單個核細胞后培養[10]，72 h后半量換液，14 d左右可見細胞鋪滿培養瓶后可進行鑒定或傳代。（1）EPCs功能學鑒定：按照文獻方法[11-12]，完成EPCs細胞表面標志物及功能學鑒定，細胞傳代備用。（2）參考文獻[13]對EPCs進行標記。取培養14 d的EPCs，將熒光染色劑DAPI加入EPCs中，終濃度為50 mg/mol，在37 ℃ CO2培養箱中孵育24 h，標記后的EPCs用無菌PBS沖洗6次，除去未結合的DAPI，熒光顯微鏡下觀察標記的EPCs。

2.2 血管內皮損傷模型的建立

根據文獻建立大鼠血管內皮損傷模型[14]，SD雄性大鼠隨機分組后，以配方為2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、3%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%基礎飼料的高脂飼料喂養，輔以VitD腹腔注射，70萬U/kg，分2次注射，高脂喂養2周后第1次注射，又2周后第2次注射，各35萬U，持續高脂飼料喂養12周。隨機取5只大鼠，觀察內膜形態，計量檢測內膜厚度，SA-β-Gal法檢測內皮衰老情況，可見大鼠主動脈內膜增厚，出現動脈粥樣硬化樣改變，內皮衰老檢測呈陽性，據此推測造模成功。

2.3 分組、給藥及處理

模型大鼠隨機分為單用補陽還五湯組（b組）、補陽還五湯聯合EPC組（B組）、單純EPC輸注組（E組），模型組（M組）共4組，并以健康SD大鼠設為空白對照組（C組），合計5個組。按組別給予藥物處理，B、b組以中藥灌胃補陽還五湯（生藥11.1 g/kg， 1次/d，連用30 d），每周稱體重調整灌胃藥量，其余各組灌胃蒸餾水。B、E組輸注數量約為2×106的DAPI標記的EPCs以1 mL PBS混懸，通過尾靜脈于給藥的第8 d一次性輸注，其余各組輸注1 mLPBS，藥物干預30 d后處死動物取材進行檢測。

2.4 血管內皮αvβ3、αvβ5、SDF-1、CXCR-4蛋白表達檢測

分組、方法同前。各組大鼠于給藥30天后即末次給藥后次日，麻醉后處死動物，取出胸腹主動脈，將組織碾磨之后收集于干凈Ep管中，Bradford 法測定蛋白質含量。用SDS-PAGE凝膠電泳法將蛋白轉移至PVDF膜后加入5%蛋白封閉液在室溫下搖動孵育2 h。加入3 mL用TBST稀釋的I抗（αvβ3、αvβ51∶1 000、SDF-1 1∶200、CXCR-4 1：1 000），4 ℃緩慢搖動過夜后加入入羊抗鼠、羊抗兔第II抗體3 mL（1∶4 000），37 ℃孵育1 h。將膜放置于熒光成像儀內，用凝膠成像系統曝光后將膠片進行掃描，用圖像分析軟件IPP 6.0對圖像進行光密度分析。

2.5 統計分析方法

運用統計學軟件SPSS 17.0進行數據分析，實驗結果所有數據均采用“x±s”表示，多組間均數比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD法，方差不齊者先將數據進行自然對數轉換后再作單因素方差分析和兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 內皮祖細胞的生長情況

原代培養細胞后48 h可見大部分細胞貼壁，72 h后可見細胞伸出偽足，5 d后可見細胞呈鋪路石狀，7 d后細胞梭行生長并開始融合，9 d左右可達到融合70%～80%，通過傳代換液后細胞呈指數生長，14 d左右可見集落形成。與單純密度梯度離心法比較，一是獲取細胞數量顯著增加；二是細胞更易融合形成集落，大大加速了生長和傳代，見圖1。

3.2 各組造模情況比較

結果顯示，M組可見血管內膜顯著增生，血管內膜中可見到SA-β-gal染色陽性，呈中等強度表達，而C組表達呈陰性。與M組比較，E組血管各層細胞排列整齊，血管內膜未見陽性表達，b組血管內膜可見弱陽性表達，而B組血管內膜未見陽性表達，見圖2。

3.3 EPCs的歸巢

熒光顯微鏡下B組和E組血管壁可見藍色熒光，尤其是在內膜部位及損傷嚴重部位的熒光表達更強；結合血管形態學及管壁計量檢測結果可見輸注EPCs的各組損傷修復較好，由此可知輸注的EPCs歸巢到損傷血管分化為內皮細胞參與了損傷血管內皮的修復，見圖3。

3.4 各組整合素表達的比較

與空白對照組比較，模型組αvβ3、αvβ5表達降低（P<0.05）。與模型組比較，各治療組αvβ3的表達均增加（P<0.05或P<0.01）；與單純EPC組比較，補陽還五湯聯合EPC組αvβ3表達有所增加但差異不明顯（P>0.05）。與單用補陽還五湯組比較，補陽還五湯組聯合EPC組αvβ3表達顯著增加（P<0.05）。與模型組比較，各治療組αvβ5的表達增加（P<0.05），但各治療組之間的比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1，圖4。

3.5 各組SDF-1、CXCR-4表達的比較

結果表明：與空白對照組比較，模型組SDF-1蛋白表達顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，補陽還五湯組聯合EPC組SDF-1蛋白表達顯著升高（P<0.01），而單用EPC組、補陽還五湯組與模型組比較無統計學意義（P>0.05）。與單用EPC組比較，補陽還五湯聯合EPC組SDF-1表達顯著增高（P<0.01）。與單用藥物組比較，補陽還五湯聯合EPC組SDF-1表達顯著高于補陽還五湯組（P<0.05）。

在CXCR-4蛋白表達方面，與空白組比較，模型組CXCR-4表達顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，b組表達下降（P<0.05），其余各治療組CXCR-4變化無統計學意義（P>0.05）。見表2、圖5。

4 討論

補陽還五湯出自清代名醫王清任《醫林改錯》，具有益氣活血之功效，為治療缺血性腦血管病及后遺癥的有效方劑。已有研究表明[15-16]該方能通過增強VEGF及受體的表達和提高蛋白水平達到保護血管內皮的作用，能通過各種途徑促進血管內皮細胞表達NO，從而達到保護血管內皮的作用[17]。在抗動脈粥樣硬化方面，補陽還五湯內服加外敷治療閉塞性周圍動脈粥樣硬化有顯著療效[18]。可以通過抑制誘導型一氧化氮合酶的表達降低動脈粥樣硬化小鼠一氧化氮水平，防治動脈粥樣硬化[19]。還能下調MMP-9的表達，降低血脂，具有抗動脈粥樣化作用[20]。由此可見，該方具有較好的改善內皮功能的作用。其作用機制主要在于降血脂、抗氧化損傷、調節內皮活性物質分泌、抗栓與促栓平衡、抗細胞凋亡等方面。

整合素是由α和β兩個亞單位組成，它們之間以非共價形式相連，目前研究已經發現形成24個異源二聚體[21]。其中αvβ3在新生血管內皮細胞有高度表達，αvβ3與配體結合后通過絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途徑使內皮細胞增殖，分化和遷移形成血管。整合素家族的粘附分子在EPC的歸巢中也起重要的作用，Schroeter等[22]發現瘦素（Leptin）能通過上調αvβ5促進EPC的修復損傷的血管。Walter等[23]的研究表明整合素αvβ3和αvβ5能加快EPC粘附至血管損傷處。另有研究表明，SDF-1/CXCR-4軸參與造血干/祖細胞、T細胞等細胞的趨化和遷移過程[24]。因而整合素與SDF-1/CXCR-4軸在EPCs的作用環節是否具有相關性有待證實。

本實驗結果表明，與模型組相比，各實驗組αvβ3、αvβ5的表達均有所增強，結合受損內皮修復情況和整合素的現代研究，可以推論αvβ3、αvβ5介導了EPC對損傷血管內皮的修復。與單用復方比較，復方聯合EPC后αvβ3的表達增加。與單獨輸注EPC組比較，藥物聯合EPC輸注組兩類整合素的表達未見明顯增加。從而提示，整合素在促進EPC歸巢方面亦有一定的積極作用，這可能與整合素的支持、粘附作用有關。

SDF-1/CXCR4調控歸巢方面，藥物聯合EPCs輸注組的SDF-1表達高于單獨輸注EPCs組，亦高于兩單獨藥物組。以上結果提示藥物聯合EPCs可能通過上調SDF-1的表達而促進EPCs遷移、歸巢，促進了損傷內皮的修復。

綜上所述，整合素αvβ3和SDF-1在EPCs的歸巢方面發揮了積極的作用，而補陽還五湯能上調前兩者的表達，促進了EPCs的歸巢，從而發揮修復損傷血管內皮的作用，兩者的表達具有一定的正相關性，從而為整合素、SDF-1/CXCR4軸作為調控EPCs的重要環節提供了實驗參考，這方面的研究尚屬空白，兩者之間的溝通機制還有待進一步研究。

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