補(bǔ)陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后Bcl—2、Bax表達(dá)的影響

廖亮英 蔡光先 周賽男

〔摘要〕 目的 探討補(bǔ)陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的影響。方法 將SD大鼠80只，雌雄各半，復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型，造模后按神經(jīng)功能缺損評分進(jìn)行分層，隨機(jī)分為5組，每組15只，分別于移植后7 d、14 d、28 d進(jìn)行神經(jīng)功能評分，采用補(bǔ)陽還五湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片予以干預(yù)，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠后采用免疫組化法檢測凋亡基因Bcl-2、Bax。結(jié)果 補(bǔ)陽還五湯能顯著減輕神經(jīng)功能缺損，Bcl-2、Bax在各時(shí)間點(diǎn)（7 d、14 d、28 d）表達(dá)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型加移植加補(bǔ)陽還五湯超微飲片組上調(diào)Bcl-2、拮抗Bax表達(dá)的作用優(yōu)于模型加移植加補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)飲片組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 補(bǔ)陽還五湯可調(diào)節(jié)腦缺血后Bcl-2、Bax的表達(dá)， 是其促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的可能機(jī)制之一，且超微飲片組的作用較傳統(tǒng)飲片組更加顯著。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)陽還五湯；局灶性腦缺血；神經(jīng)干細(xì)胞；細(xì)胞移植；Bcl-2；Bax

〔中圖分類號〕R289.3；R255.2 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.007

Effects of Buyang Huanwu Ultra-Fine Powder on Apoptosis Gene Bcl-2 and Bax of Transplanted Neural Stem Cells in Rats with Focal Cerebral Ischemia

LIAO Liangying1， CAI Guangxian2*， ZHOU Sainan2

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China；

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Buyang Huanwu ultra-fine powder on apoptosis protein of Bcl-2 and Bax in transplanted neural stem cells in rats with focal cerebral ischemia. Methods Eighty Sprague-Dawley rats， half male and half female， were copyed the focal cerebral ischemia models， which were randomly divided into five groups， 15 rats in each group. The model rats were intervened by using Buyang Huanwu ultra-fine powder and traditional decoction. At 7 d， 14 d and 28 d of post-tansport， the neural function defect scale was measured. The rats were sacrified at according time. Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemical staining. Results Buyang Huanwu decoction could improve the neurological defect. Compared with model group， the expression of Bcl-2 and Bax increased obviously at different time points （7 d， 14 d， 28 d）， the differnces were statistically significant （P<0.05）. The model-transplantation-Buyang Huanwu ultra-fine powder group in increasing Bcl-2 and decreasing Bax was better than the model-transplantation-traditional Buyang Huanwu decoction， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Buyang Huanwu decoction could regulate the expression of Bcl-2 and Bax protein after cerebral ischemia， which may be one of mechnisms of promoting the recovery of neural function. The effect of Buyang Huanwu ultra-fine powder was better than traditional decoction.

〔Keywords〕 Buyang Huanwu decoction； cerebral ischemia； neural stem cell； cell transplantation； Bcl-2； Bax

缺血性腦血管病（ischemic cerebral vascular dis

ease，ICVD）以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率嚴(yán)重危害著人們的身體健康，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[1]。補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)治療缺血性腦損傷的有效經(jīng)典方，能夠降低患者的致殘率[2]。Bcl-2和Bax基因是細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)節(jié)基因，研究表明腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)重建的機(jī)制可能與神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)控基因密切相關(guān)，本試驗(yàn)擬探討超微補(bǔ)陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后Bcl-2、Bax表達(dá)的影響及其作用特點(diǎn)，以更好地應(yīng)用于臨床。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥物

補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)飲片：處方來源于《醫(yī)林改錯(cuò)》，組成如下：黃芪120 g，赤芍10 g，川芎10 g，全當(dāng)歸10 g，干地龍10 g，紅花10 g，桃仁10 g，藥材購自我院藥劑科，經(jīng)鑒定均為道地藥材，符合《藥典》規(guī)定，一煎加水500 mL，煎汁150 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL，兩煎混合，文火煎成膏狀（每mL含生藥1.5 g），4 ℃冷藏備用。補(bǔ)陽還五湯超微飲片：取傳統(tǒng)補(bǔ)陽還五湯劑量的1/3并混合，采用震動(dòng)粉粹技術(shù)（用貝利粉碎機(jī)），將黃芪、赤芍、川芎、全當(dāng)歸、干地龍、紅花粉碎至1～75微米，桃仁粉碎至200～400微米（40～80目），收集微粉，一煎加水500 mL，煎汁150 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL，兩煎混合，文火煎成膏狀（每mL含生藥0.5 g），4 ℃冷藏備用。

1.2 試劑

DMEM/F12粉由Hyclon公司提供；bFGF由R&D公司提供；B27添加物、EGF由GLBCO公司提供；胰酶、EDTA、Qtracker Cell Labeling Kit Protocol、 Rabbit Anti-Bcl-2抗體，產(chǎn)品批號：BA0412、Rabbit Anti-Bax抗體，產(chǎn)品批號：BA0315，均由武漢博士德生物工程公司提供；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，產(chǎn)品批號：MK1022，由長沙麗欣生物公司提供；水合氯醛、0.01MPBS、Triton-X100、雙氧水、甲醇、無水甘油由長沙麗欣生物公司提供；SABC試劑盒、AEC顯色劑、多聚賴氨酸包埋玻片、水溶性封片劑由北京中杉生物公司提供。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠80只，清潔級，體質(zhì)量（280±20） g，雌雄各半，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號：004535，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK（滬）2003-0002。

1.4 儀器與器械

BX-51光學(xué)顯微鏡、AlphaImager顯微圖像分析系統(tǒng)、IX71倒置顯微鏡、CCD攝像頭（日本Olympus公司）；Galaxy 170R CO2培養(yǎng)箱（shell lab 公司）；WP8025鼠腦立體定位儀（美國WPI公司）；TDZS-WS臺式離心機(jī)（湘儀）；Pureloab Classic UVF 超純水儀（Millopor 公司）；E60冰凍切片機(jī)（英國shamton公司）；BFM-T6B2微粉機(jī)（濟(jì)南貝利公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代 參考本研究團(tuán)隊(duì)建立的方法[3]從新生3～5 d SD大鼠腦內(nèi)分離純化。

2.1.2 模型制備 參考文獻(xiàn)[3]采用大腦中動(dòng)脈線栓法復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型，造模后有5只SD大鼠死亡。待動(dòng)物清醒24 h后，參考文獻(xiàn)[3]采用Zea Longa神經(jīng)功能缺失評分標(biāo)準(zhǔn)初步評價(jià)動(dòng)物造模情況。

2.1.3 細(xì)胞標(biāo)記 參考文獻(xiàn)[4]采用量子點(diǎn)的標(biāo)記方法。

2.1.4 細(xì)胞移植 參考文獻(xiàn)[5]采用側(cè)腦室細(xì)胞移植的方法。

2.1.5 動(dòng)物分組與給藥 將造模后的SD大鼠按神經(jīng)功能缺損評分進(jìn)行分層，隨機(jī)分為5組：模型組（A組）、模型+空白移植組（B組），模型+移植組（C組），模型+移植+補(bǔ)陽傳統(tǒng)飲片組（4.57 g/kg，D組），模型+移植+補(bǔ)陽超微飲片組（1.52 g/kg，E組），每組各15只。動(dòng)物手術(shù)后分別觀察存活7、14和28 d，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只。各組分別灌胃給藥，A組和B組給予等體積生理鹽水，給藥體積均為10 mL/kg，每天給藥1次。

2.1.6 神經(jīng)功能評價(jià) 參照文獻(xiàn)[3]分別于處死前進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

2.1.7 動(dòng)物處理 動(dòng)物注射細(xì)胞后分別存活7、14、28 d，參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行組織處理。

2.1.8 存活細(xì)胞檢測 采用免疫組化法檢測Bcl-2、Bax，嚴(yán)格按照試劑說明書完成，每只動(dòng)物隨機(jī)取海馬部位切片5張，置于100倍物鏡下，每張切片隨機(jī)選3個(gè)視野，用 Olympus Micro Image 4.0圖像處理系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)數(shù)免疫陽性細(xì)胞數(shù)。

2.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“x±s”表示。多組間均數(shù)比較用方差分析，方差分析前先進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，滿足條件者用F檢驗(yàn)，F(xiàn)檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者，再進(jìn)行兩兩比較；兩兩比較方差齊者用SNK法，方差不齊者用Tamhane′s T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 結(jié)果

2.2.1 細(xì)胞標(biāo)記情況 在神經(jīng)干細(xì)胞液中加入量子點(diǎn)標(biāo)記液后，絕大多數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞被標(biāo)記，而且由其傳代分化的細(xì)胞亦被標(biāo)記。

2.2.2 補(bǔ)陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后Bcl-2表達(dá)的影響 C組Bcl-2表達(dá)水平較A、B組增加，D、E組Bcl-2表達(dá)水平較C組增加，E組上調(diào)Bcl-2表達(dá)較D組明顯，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組內(nèi)比較：三組在7、14、28 d Bcl-2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1，圖1-3。

2.2.3 補(bǔ)陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后Bax表達(dá)的影響 C組Bax表達(dá)水平較A、B組增加，D、E組Bax表達(dá)水平較C組減少，說明D、E組均能下調(diào)Bax表達(dá)，E組下調(diào)Bax表達(dá)較D組明顯，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組內(nèi)比較三組在7、14、28 d Bax表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2，圖4-6。

3 討論

缺血性腦血管疾病是目前嚴(yán)重危害人類生命健康的主要疾病之一，其高發(fā)病率和致殘率使得對該病的研究成為熱點(diǎn)。腦組織受損后，構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位——神經(jīng)元大量丟失導(dǎo)致腦功能缺失，而定向誘導(dǎo)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[6]，且神經(jīng)干細(xì)胞在體外無限增殖，可促使神經(jīng)受損后神經(jīng)功能的恢復(fù)[7]，是治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變或缺失疾病的有效途徑之一。Bcl-2和Bax基因是細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)節(jié)基因，Bcl-2和Bax可通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，也可獨(dú)立地調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[8]。

補(bǔ)陽還五湯是治療缺血性腦損傷的經(jīng)典方，能夠降低患者的致殘率，提高生存質(zhì)量[9]。本研究團(tuán)隊(duì)前期結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯能促進(jìn)缺血后腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、分化[10]，可調(diào)節(jié)腦缺血后caveolin1、2的表達(dá)[11]，這可能是其促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)機(jī)制之一[12-13]。

本研究采用導(dǎo)師多年的研究成果補(bǔ)陽還五湯超微飲片進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，腦缺血損傷神經(jīng)干細(xì)胞移植后Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，其量效關(guān)系體現(xiàn)在腦缺血后模型加移植加補(bǔ)陽還五湯超微飲片1.52 g/kg對腦缺血后大鼠Bcl-2、Bax表達(dá)的影響作用優(yōu)于模型加移植加補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)飲片4.57 g/kg；提示補(bǔ)陽還五湯超微飲片的臨床用藥劑量可采用其傳統(tǒng)飲片臨床等效劑量的1/3。

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