美洲大蠊提取液對慢性難愈合創面Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白調控研究

李文華 伍偉明 劉筱 楊敏 周雯婷 曾娟妮

〔摘要〕 目的 觀察美洲大蠊提取液對大鼠慢性難愈合創面組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的表達，探討其促愈機制。方法 將48只SPF大鼠隨機分為急性創面對照組，慢性創面模型組、貝復濟陽性組及美洲大蠊實驗組，藥物干預5、7、11 d后分批留取創面組織并處死，運用PCR方法測定創面組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達。結果 Ⅰ、Ⅲ型膠原在各組中的表達趨勢曲線一致，第5天，對照組表達最高，模型組最低，從第5天開始，美洲大蠊實驗組中Ⅰ、Ⅲ型膠原中表達呈上升趨勢并高于陽性組，第7天達到高峰后逐漸穩定下降，第11天略低于陽性組（P<0.01）。結論 美洲大蠊提取液能有效提高大鼠難愈合創面前中期Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的表達從而促進創面愈合，并在后期能有效降低膠原蛋白的過度表達而減少瘢痕形成。

〔關鍵詞〕 美洲大蠊提取液；慢性難愈合創面；Ⅰ型膠原蛋白；Ⅲ型膠原蛋白

〔中圖分類號〕R285.5；R393 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.005

Study of American Cockroach Extraction Solution in Regulating the TypeⅠ/Ⅲ

Collagen of Chronic Wound

LI Wenhua1， WU Weiming1， LIU Xiao1， YANG Ming1， ZHOU Wenting1， ZENG Juanni2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China； 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of American Cockroach extraction solution on the expression of typeⅠ/Ⅲ collagen in tissue of the chronic wound in rats， and to investigate the healing mechanism. Methods The 48 SPF rats were randomly divided into the acute wound control group （control group）， the chronic wound model group （model group）， the positive group and the experimental group. The research group kept a part of wound tissue in batches on 5th， 7th， 11th day after drug intervention and executed the whole rats finally. Expression quantity of type collagenⅠ/Ⅲ mRNA in wound tissue was measured by polymerase chain reaction （PCR）. Results The curves of expression variation of collagen type I and Ⅲ were consistent in each group. On the 5th day， the expression quantity in the control group was highest and the model group's was lowest. Collagen type I/Ⅲ of the experimental group was on the rise from the 5th day and it was higher than that of positive group， it kept steadily after reaching the peak on the 7th day， and it was slightly lower than that of the positive group on 11st day （P<0.01）. Conclusion American cockroach extraction solution could improve the expression of typeⅠ/Ⅲ collagen of skin tissue in the middle time of the chronic wound healing of rats effectively， and it could reduce the excessive expression of collagen effectively so as to reduce the scar formation.

〔Keywords〕 American cockroach extraction solution； chronic wound； type I collagen； type Ⅲ collagen

慢性難愈合創面是指創面在各種內外因素作用下不能通過正常的愈合進程達到解剖和功能上的完整，從而進入一種病理性炎癥反應狀態，最終導致經久難愈[1]。臨床上多指各種原因形成的創面經30 d以上治療未能愈合，也無愈合傾向者[2]。主要見于大面積創面燒傷、糖尿病潰瘍、壓迫性潰瘍等。隨著患病率的逐年上升，皮膚難愈合創面的長期護理耗費了高昂的治療費用及醫療資源，給患者造成了精神、身體的雙重痛苦。研究者也針對病因病理展開了大量研究，近年生物分子技術的快速發展，使創面愈合的方法在細胞外基質、干細胞、轉基因干細胞水平等方面的研究取得了一定成果，但其靶向性、高效性及安全性尚未完全解決，在臨床上的應用仍需要一定過程，因此，在外科創面修復中亟待尋找一種安全、有效、價廉的方法。已經證實在影響創面愈合的諸多因素中，生長因子的分泌[3]及細胞外基質成分（extracellular matrix，ECM）的合成/降解[4]在創面愈合過程中起著至關重要的作用[5]。ECM對細胞的遷徙、增殖、分化和組織的重構有著重要作用[6]，而膠原蛋白是ECM的主要組分，在皮膚中主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原。美洲大蠊具有養陰生肌、通利血脈等作用，其提取物已經逐漸應用于臨床慢性皮膚潰瘍并取得了較好的修復療效，但其促愈機制的實驗研究報道仍然很少。課題組在前期實驗中發現美洲大蠊提取液在肉芽生長期上調TGF及VEGF表達來加速創面愈合[7]，基于此，本實驗利用PCR檢測肉芽組織膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ型膠原，進一步研究美洲大蠊的促愈機制，豐富中醫外治方法及理論。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

2月齡、體質量為200～250 g的SPF級大鼠48只，雌雄各半，由湖南中醫藥大學動物中心提供（合格證號：43004700026384），混合飼料單籠飼養，適應性喂養1周。

1.2 主要實驗藥物及試劑

美洲大蠊提取液100 mL/瓶（商品名：康復新，編號：B14000063390）由四川好醫生藥業集團生產，貝復濟15 mL/瓶（國藥準字S10980075）珠海億勝生物制藥有限公司生產。DNA Marker（Fermentas公司 批號：SM0672）；Trizol（美國GIBCO公司 批號：15596-026）；Real-time PCR mix（thermo fisher公司 批號：4367659）；Gold View核酸染料、瓊脂糖粉、氯仿、引物由上海生物工程有限公司提供。

1.3 主要實驗儀器

F2微量移液器（美國thermo fisher公司）；ChemiDoc MP凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）；TGradientPCR儀（德國Biometra公司）；BioPhotometer D30核酸蛋白分析儀、5810R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）

2 方法

2.1 大鼠創面分組與模型的建立

48只大鼠中隨機取12只建立大鼠急性創面對照組（簡稱對照組），其余36只制備慢性難愈合創面模型，再隨機均分為美洲蠊實驗組（簡稱實驗組）、貝復濟陽性對照組（簡稱陽性組）、模型組，各組均為12只。急性創面對照組模型：對照組大鼠在造模區常規備皮，然后行全層皮膚切除，但不使用藥物干預處理；慢性難愈合創面模型制備：參照付小兵[8]全層皮膚缺損法經改進制成大鼠慢性難愈合創面模型。大鼠腹腔注射鹽酸胺酮（100 mg/kg）麻醉后，在腰椎正中偏上備皮，用直徑約為2 cm的硬幣標記面積造模，無菌條件下在造模區用外科方法作兩條深達筋膜、直徑為2 cm的全層皮膚缺損開放性創面，即刻皮下注射醋酸氫化可的松（6 mg/100 g）。

2.2 創面換藥及取材

各組換藥前均以1/5 000呋喃西林液清潔創面2次，每日換藥2次。實驗組及陽性組分別使用美洲大蠊體提取液紗條（0.2 ml/cm2）、貝復濟藥物紗條（60 U/cm2），模型組及對照組外敷兩層生理鹽水紗布（0.2 mL/cm2），然后加蓋紗布并膠布固定。分別在5、7、11 d 3個時間點每組隨機取3只大鼠，均采用相同部位，平行創面剪取0.5 cm×0.5 cm大小深達真皮層創面組織，質量約50 mg，置于10%甲醛溶液進行固定中備用。所有大鼠均在第11天取材后統一處死。2.3 指標及檢測方法

2.3.1 RT-PCR檢測I/III型膠原的引物設計 根據超純RNA提取試劑盒的要求提取樣本的總RNA并按說明進行操作，Ⅰ型膠原引物序列：上游5-TGAGCCAGCAGATTGAGAAC-3，下游5-CCAGTGTCCATGTCGCAGA-3，PCR擴增片段長度為470 bp；Ⅲ型膠原引物序列：上游5-TTCCTTTTGTTCTAATCTTGTCA-3，下游5-TAGCACCATTGAGACATTTTGA-3，PCR擴增片段長度為224 bp；β-actin（內參定量）引物序列為：上游5-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3，下游5-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3，PCR擴增片段長度為495 bp。2.3.2 RNA提取及逆轉錄 從固定的肉芽組織中提取RNA并反轉錄得到cDNA，并以該cDNA為模板，用針對目的基因設計合成的PCR引物進行real-time PCR，以檢測組織中目的基因的表達。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度各組樣本總RNA濃度在0.301～0.568 μg/mL，A260/A280在1.821～1.945間，符合實驗要求。第一鏈cDNA合成：取1.0 μg Total RNA加Nuclease-Free Water到無RNA酶的EP管中，混勻后離心，70 ℃溫浴10 min，立即置于冰上；按一定比例將其他試劑加入反應體系中（冰上進行），混勻，短暫離心；42 ℃反應15 min，然后在70 ℃水浴鍋中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活；將得到cDNA置于-20 ℃保存備用。

2.3.3 I/III型膠原的PCR檢測 （1）按照一定比例配制反應體系20 ？滋L：將12×Real-time PCR mix/2×PCR mix10 ？滋L、cDNA模板1 ？滋L、上下游引物各1 ？滋L、ddH2O 7 ？滋L混勻；（2）擴增程序： 94 ℃ 4 min預變性；94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，擴增40 cycle，72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存 。

2.3.4 指標測定 以1.2%瓊脂糖凝膠，在 0.5×TBE緩沖溶液中電泳進行PCR產物鑒定，ChemiDoc MP凝膠成像分析儀在反射紫外燈下全自動圖像掃描，分析Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA光密度值結果。

2.4 統計學方法

實驗數據用SPSS 17.0統計分析軟件處理，該計量資料以“x±s”表示，符合正態分布，方差齊，則多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，反之采用Kruskal Wallis H檢驗，P<0.05表示有統計學差異，P<0.01表示統計有顯著意義。

3 結果

3.1 Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達

從表1、表2可以看出，Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達趨勢呈一致，第5～11天，模型組、陽性組、實驗組Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA相對表達量顯著低于對照組，模型組最低（P<0.01），第5～7天，實驗組Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA高于陽性組（P<0.01），第11天，實驗組Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA相對表達量低于陽性組（P<0.01）。

3.2 Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比值

各組的I型膠原蛋白在修復過程中基本占主體地位，Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比值，對照組最高，陽性組最低，模型組的在第7天兩者比值表達略低于第5、11天；實驗組的Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值呈逐漸上升趨勢。結果見表3。

各組中，各階段Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比值，對照組最高，陽性組最低。對照組前7天呈上升，而后下降趨勢，表明前中期Ⅰ型膠原蛋白占主體，后期稍有下降；模型組第5天在修復過程中，兩者比值達到最高，第7天下降，而后又逐漸上升，表明前期Ⅰ型膠原蛋白占主導，中期比率相對下降，后期Ⅲ型膠原蛋白比率上升；陽性組在修復過程中的前7天兩者比重相差不大，第7天以Ⅲ型膠原為主體；實驗組中兩者比值呈逐漸上升趨勢，表明前中期Ⅲ型膠原的比重較大，而后期相對下降，以Ⅰ型膠原蛋白為主體，見表3。

3.3 PCR檢測Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA電泳結果

Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達電泳結果，第1～3泳道是急性創面對照組，第4～6泳道是慢性創面模型組， 第7～9泳道是貝復濟陽性組，第10～12泳道是美洲大蠊提取液實驗組，可反映出4組之間Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基因條帶大小和亮度有一定的差異及趨向性，對照組條帶大小及亮度明顯高于其余三組；對照組、模型組、陽性組Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基因條帶第5、7天大體一致，第11天亮度最高，而實驗組呈現一定上升趨勢，且第7天條帶大小及亮度最高，見圖1-3。

4 討論

膠原蛋白是一種結構呈三維螺旋狀的纖維蛋白質，所形成的螺旋如網狀般相互聚合，能堅固地支撐組織結構，使創面富有強韌彈性，占人體蛋白總量的30%，主要分布于皮膚、黏膜等。其在器官的營養、組織修復、細胞分化等方面發揮重要作用，促進成纖維細胞的分化及加快新生血管、基質的形成，進一步激活巨噬細胞的吞噬功能從而提高機體免疫力，顯著減少了創面的感染率。此外，膠原蛋白的降解產物—羥基脯氨酸是機體修復細胞所必須的氨基酸，能為創面的修復提供豐富的營養物質[9]，促進肉芽組織生長。而其中Ⅰ、Ⅲ型膠原在創面修復過程與修復質量中起著至關重要的作用，Ⅰ型膠原粗大且擴張能力強，Ⅲ型膠原纖細且柔韌性好[10]。Ⅰ型膠原占主體，決定組織的高韌性，Ⅲ型膠原包繞于外周，決定組織的柔韌性和彈性，Ⅲ型膠原比Ⅰ型膠原纖維纖細。Ⅰ型膠原占膠原總量的80%～85%，Ⅲ型膠原占膠原總量的15%～20%，Ⅲ型膠原含量越高，膠原纖維越細，彈性越好，瘢痕越輕，但膠原過度沉積也是瘢痕愈合形成的直接原因[11-12]。因此，Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比值關系決定最終的修復質量。在創面愈合早期，Ⅲ型膠原蛋白對創面的修復發揮著重要的作用，Ⅲ型膠原相對Ⅰ型膠原相應的比率上升，肉芽組織及早期瘢痕富含Ⅲ型膠原而富有彈性；之后，Ⅰ型膠原蛋白比例上升并占絕對優勢，組織強度增高使瘢痕明顯。但若是Ⅰ、Ⅲ型膠原含量大量增加，明顯高于正常皮膚組織，則會造成明顯的瘢痕疙瘩。

美洲大蠊提取液，是基于云南大理白族人民使用蜚蠊治療惡瘡的有效經驗從蜚蠊藥材中分離、精制而成的生物制劑。現代藥理研究證明其具有消除炎性水腫、提高機體免疫力、加快壞死組織脫落、促進肉芽組織生長及血管增生等多種作用，從而可加速各類潰瘍及慢性難愈合創面的修復進程；而在中醫藥研究中，美洲大蠊提取物具有通利血脈、散瘀活血、養陰生肌的作用，包含著中醫扶正驅邪相輔相成的治療法則，其通利、散瘀的成分能有效的祛除局部的瘀血邪毒， 疏通經絡，通利血脈，達到通則不痛的目的。臨床觀察上已證實該藥物外用可快速激活局部免疫細胞，縮短創面愈合時間[13-14]。此外，筆者在臨床中將美洲大蠊提取物外用于肛管難愈合創面，取得滿意療效[15]。并在前期實驗研究[7]發現美洲大蠊提取液能提高慢性難愈合創面VEGF的表達，從而加速創面的修復。

本實驗顯示，第1～7天美洲大蠊提取液加速Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達，第7天達到峰值，且Ⅰ型膠原占主體、Ⅲ型膠原相對比值較大，說明前中期美洲大蠊提取液能促進膠原合成，加速創面愈合；第7～11天，Ⅰ型膠原蛋白比例稍上升，但總膠原mRNA表達緩慢下降，說明美洲大蠊提取液能進一步促進創面的組織化、且有效降低創面愈合后期膠原含量，從而減少瘢痕形成。

參考文獻：

[1] 楊宗城.中華燒傷醫學[M].北京：人民衛生出版社，2008：256.

[2] 姜玉峰，付小兵.體表慢性難愈合創面的研究進展[J].感染·炎癥·修復，2011（1）：59-61.

[3] YOKO T， HIDEFUMI M， HIDEKI S， et al. Expression and effects of epidermal growth factor on human periodontal ligament cell[J]. Cell Tissue Res， 2014（357）：633-643.

[4] WIGHT T N， POTTERPERIGO S. The extracellular matrix： an active or passive player in fibrosis？[J]. American Journal of Physiology Gastrointestinal & Liver Physiology， 2011， 301（6）：950-955.

[5] 馬慧軍，賈赤宇，魏 蓉，等.膠原蛋白凝膠促皮膚創面修復的臨床研究[J].中國美容醫學雜志.2011，20（2）：235-236.

[6] CLAUSE K C， BARKER T H. Extracellular matrix signaling in morphogenesis and repair[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2013， 24（5）：830.

[7] 曾娟妮，劉 筱，伍偉明，等.美洲大蠊提取液對大鼠難愈合創面VEGF表達影響的研究[J].中國民族民間醫藥，2016，25（19）：64-66.

[8] 付小兵，孫同柱，盛志勇.幾種用于創傷修復研究的動物模型[J].中華實驗外科雜志，1999，16（5）：479-480.

[9] 王曉芹，王貴波，李曉輝.創面敷料及其對愈合的影響研究進展[J].中國臨床康復，2002，6（4）：574-575.

[10] 何澤亮.結締組織生長因子對創面再生和瘢痕愈合中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響[D].蘭州：蘭州大學，2015.

[11] 郝 劍，易成剛，陶 諫.中藥治療慢性難愈性創面的研究進展[J].中國美容醫學，2005，14（6）：775-777.

[12] 張民福，許春鵬.急性運動創傷中應用堿性成纖維細胞生長因子促傷口愈合的療效觀察[J].福建體育科技，2007，26（4）：34-35.

[13] 李 莉，唐文華，徐月芳.康復新液治療頭面部燒傷36例效果觀察[J].齊魯護理雜志，2010，16（23）：57-58.

[14] 魏 強，楊運芳.康復新液治療復發性阿弗他潰瘍112例近期療效觀察[J].中國健康月刊·A版，2010：235-236.

[15] 伍偉明，金麗穎，王真權，等.康復新液治療肛管難愈合創面的臨床研究[J].中醫藥導報，2015，21（22）：71-73.