祛風活血丸對實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達的影響

秦漢 喻京生 賀莉 王顥筱 高健 姚琬華

〔摘要〕 目的 觀察祛風活血丸對實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠視網膜JAK2及STAT3 mRNA表達的影響。方法 將80只（160眼）雄性Lewis大鼠根據隨機數字表法隨機抽取16只作為空白組（A），對其余64只大鼠進行實驗性自身免疫性葡萄膜炎模型制作。造模成功后，根據隨機數字表法將其隨機分為模型組（B）、祛風活血丸常規劑量組（C）、祛風活血丸兩倍劑量組（D）、熊膽開明片組（E）。干預14 d后用qPCR法檢測大鼠視網膜組織中JAK2 mRNA和STAT3 mRNA的相對表達量。結果 JAK2 mRNA：與B組比較，C組、E組表達降低，差異具有統計學意義（P<0.05），D組表達顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.01）；STAT3 mRNA：與B組比較，C、D、E組表達均降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 祛風活血丸能降低實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠JAK2、STAT3 mRNA的表達，抑制JAK2/STAT3信號通路，達到抗炎作用。

〔關鍵詞〕 實驗性自身免疫性葡萄膜炎；祛風活血丸；JAK2/STAT3信號通路；JAK2 mRNA；STAT3 mRNA

〔中圖分類號〕R285.5；R393 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.004

Effects of Qufeng Huoxue Pill on JAK2 mRNA and STAT3 mRNA Expression in

Experimental Autoimmune Uveitis Rats

QIN Han1， YU Jingsheng2*， HE Li1， WANG Haoxiao1， GAO Jian1， YAO Wanhua1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China；2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Qufeng Huoxue pill on expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA of retinal ganglion cells in experimental autoimmune uveitis rats. Methods According to the random number table method， 16 rats from 80 male Lewis rats （160 eyes） were randomly selected as the blank group （group A）， and the other 64 rats were built for experimental autoimmune uveitis models. After the success of modeling， the rats were randomly divided into model group （group B）， conventional dose of Qufeng Huoxue pill group （group C）， double doses of Qufeng Huoxue pill group （group D）， Xiongdan Kaiming tablet group （group E）. After 14 days of administration， the relative expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA in retinal tissue of rat was detected by Real-time fluorescence quantitative PCR. Results JAK2 mRNA： compared with group B， the expression of group C and group E decreased obviously， the difference was with statistical significance （P<0.05）， the expression of group D decreased significantly （P<0.01）. STAT3 mRNA： compared with group B， the expression of group C， D and E decreased significantly， there was statistical significance （P<0.05）. Conclusion Qufeng Huoxue pill could reduce the expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA in experimental autoimmune uveitis rats and inhibit the JAK2 / STAT3 signaling pathway to achieve anti-inflammatory effect.

〔Keywords〕 experimental autoimmune uveitis； Qufeng Huoxue pill； JAK2 / STAT3 signal pathway； JAK2 mRNA；STAT3 mRNA

葡萄膜炎是一組種類繁多、治療棘手的眼病，多發生于青壯年，是全球范圍內引起致盲和視覺缺陷的主要原因之一，其發病機制主要為自身免疫反應[1]。近年研究認為Th17細胞在自身免疫性葡萄膜炎的發生發展過程中發揮更為重要的作用，它主要由IL-23誘導產生[2-3]。Janus 激酶（janus kinase，JAK）/信號轉導子和轉錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路，即JAK/STAT通路是介導細胞因子信號轉導的重要途徑，在調節機體炎癥反應中發揮重要作用[4]。IL-23信號需通過JAK/STAT信號通路的轉導發揮生物學效應，JAK2、STAT3是此信號通路的主要調節因子[5-6]。實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveoreti-nitis，EAU）是一種T細胞介導、靶器官特異的自身免疫相關的疾病，由大鼠所誘導的EAU模型是研究人類葡萄膜炎的經典動物模型[7-8]。

祛風活血丸具有祛風清熱、養血活血的功效，臨床應用多年，在治療葡萄膜炎方面取得良好療效[9-10]。因此，本實驗通過建立實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型，從JAK2、STAT3兩個靶點入手，觀察祛風活血丸對實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠JAK2/STAT3信號通路的干預作用，探究其防治葡萄膜炎的作用機制，為該藥的臨床應用提供實驗佐證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試藥物 祛風活血丸由熟地黃、當歸、川芎、柴胡、黃芩、菊花、防風、魚腥草等藥物組成，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科配制而成。批號：20170308，規格：每丸重約0.2 g，用時以蒸餾水溶散為質量分數100 mg/mL的懸濁液，置于4 ℃冰箱中保存；熊膽開明片由熊膽粉、石決明、菊花、枸杞子、澤瀉、茺蔚子等藥物組成，吉林長白山藥業集團股份有限公司產品，批號：170201，規格：0.35 g/片，用時以蒸餾水溶散為質量分數8 mg/mL的懸濁液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 動物 Lewis大鼠80只，雄性，6～8周齡，體質量150～180 g，SPF級，經檢查均健康無眼疾，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.1.3 主要試劑、儀器 光感受器間維生素A類結合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP）多肽片斷ADGSSWEGVGVGVVPDV，上海生工生物工程股份有限公司合成，批號：P14198；Freund完全佐劑（FCA），購自Sigma公司，批號：BJ0120392；PBS溶液，購自北京索萊寶科技有限公司，批號：P1032；TRIzol Reagent試劑，批號：R1022，熒光定量PCR預混液SYBR Green qRCR Mix，批號：P2092，購自廣州東盛生物科技有限公司；DEPC（焦炭酸二乙酯），購自Sigma公司，批號：V900882；mRNA逆轉錄試劑盒，購自Thermo公司，批號：K1622；熒光定量PCR儀，ABI公司產品；核酸定量儀，Thermo公司產品；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠產品；OMS-23手術顯微鏡，TOPCON公司產品。

1.2 分組及干預

1.2.1 EAU大鼠模型制作[11] 造模組大鼠分別于兩側大腿內側皮下緩慢注射0.1 mL含有30 μg IRBP1177-1191的FCA乳糜液1次。空白組大鼠在相同部位注射等劑量蒸餾水1次。

1.2.2 驗證模型 造模后在裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠眼前節改變，以出現虹膜血管擴張、虹膜后粘連、前房滲出、角膜緣血管充血（睫狀充血）、晶狀體前囊有灰白色絮狀沉著物、瞳孔膜閉以及玻璃體混濁等炎性改變作為EAU大鼠模型制作成功的標志。

1.2.3 動物分組 80只Lewis大鼠根據隨機數字表法隨機抽取16只作為空白組（A），對其余64只大鼠進行EAU模型制作。造模成功后，根據隨機數字表法將其隨機分為模型組（B）、祛風活血丸常規劑量組（C）、祛風活血丸兩倍劑量組（D）、熊膽開明片組（E）。

1.2.4 干預方法 造模后第7天開始干預，給藥劑量按人鼠體表面積折算法計算，祛風活血丸常規劑量組按4 g/（kg·d）劑量灌胃，祛風活血丸兩倍劑量組按8 g/（kg·d）劑量灌胃，熊膽開明片組按0.5 g/（kg·d）劑量灌胃，空白組、模型組以蒸餾水4 mL灌胃，每日1次，連續干預14 d。

1.3 視網膜組織取材

干預14 d后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，充分暴露眼球于眼眶緣，用眼科剪分離球結膜及球后結締組織，鑷住眼球后極部的視神經，用彎剪小心剪斷視神經，取出大鼠眼球。參考Mcmenamin[12]方法在手術顯微鏡下進行取材，將取出的視網膜組織放入1.5 mL微量離心管中，滴入100 μL總RNA提取試劑（Trizol），-80 ℃冰箱保存。

1.4 qPCR法檢測大鼠視網膜組織中JAK2 mRNA和STAT3 mRNA的表達

采用Trizol法抽提大鼠視網膜組織中總RNA，進行逆轉錄反應，總反應體系20 μL，42 ℃水浴1 h，然后在70 ℃反應10 min使Reverse Transcriptase失活，合成cDNA。取上述反應液1 μL作為熒光定量的模板，反應體系總體積為10 μL。JAK2上游引物為5-AGATGTGC-CGCTATGACC-3，下游引物為5-CTCTTCCGTG-CTGTGCTG-3；STAT3上游引物為5-GCTTCT-CGTTCTGGGTCTG-3，下游引物為5-GTCTTGCCACTGAT-GTCCTT-3；β-actin上游引物為5-AGGCCCCTCTGAACC-CTAAG-3，下游引物為5-CCAGAGGCATACAGGGACAAC-3。β-actin作為內參，2-△△CT法計算相對表達量。

1.5 統計學分析

數據采用“x±s”表示，運用SPSS 22.0軟件包進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD法，方差不齊者用Dunnetts T3法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EAU大鼠模型驗證

造模后在裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠眼部反應，模型組出現一系列不同程度的炎癥反應，與葡萄膜炎一致，空白組未觀察到炎癥反應。造模后第5天，觀察到炎癥反應，表現為虹膜血管輕度擴張、角膜緣血管充血；造模后第7天，出現葡萄膜炎反應，表現為不同程度的前房混濁、角膜后壁沉著物（KP）、房水閃輝、瞳孔縮小，部分出現晶狀體前灰白色絮狀物；造模后第10天，出現明顯葡萄膜炎反應，表現為虹膜血管明顯擴張、房水混濁、前房變淺、前房積膿、KP、瞳孔緣灰白色絮狀物、瞳孔膜閉等體征（見圖1）。模型組大鼠一共64只，其中有56只出現不同程度的葡萄膜炎反應，造模成功率為87.5%。

2.2 大鼠視網膜組織中JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對表達量

JAK2 mRNA相對表達量：與模型組比較，祛風活血丸常規劑量組、熊膽開明片組表達均降低，差異具有統計學意義（P<0.05），祛風活血丸兩倍劑量組表達明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。見表1。

STAT3 mRNA相對表達量：與模型組比較，祛風活血丸常規劑量組、祛風活血丸兩倍劑量組、熊膽開明片組表達均降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1，圖2-圖4。

3 討論

自身免疫性葡萄膜炎是一種與視網膜蛋白免疫反應相關的致盲性眼病[13]。目前，免疫抑制劑仍是自身免疫性葡萄膜炎的主要治療藥物，長期使用副作用明顯[14]。近年來，中藥因其獨特優勢在葡萄膜炎的治療中逐漸受到關注。葡萄膜炎分別屬于中醫學“瞳神緊小”（《證治準繩》）、“瞳神干缺”（《秘傳眼科龍木論》）、“云霧移睛”（《證治準繩》）、“視瞻昏渺”（《證治準繩》）等范疇。眼位居高，易受風邪，風為陽邪，肝為風木之臟，開竅于目，同氣相求，故眼病的發生多與風邪有關；熱亦為陽邪，其性升騰上炎，最易上沖頭目，引起眼疾；風熱二邪常常合而侵襲眼目，葡萄膜具有多氣多血的特點，外邪侵犯時易造成局部氣機郁滯，血行不暢，久之則形成氣滯血瘀之象，因此，本病的基本病機可歸納為外感風熱、氣滯血瘀。祛風活血丸是湖南中醫藥大學第一附屬醫院眼科院內制劑，主要由熟地黃、當歸、川芎、柴胡、黃芩、菊花、防風、魚腥草等藥物組成，方中防風祛風止痛；黃芩、魚腥草清熱解毒；熟地黃、當歸、川芎補血斂陰，活血行氣，補而不滯，能使營血調和；菊花清肝明目；柴胡疏肝解郁；諸藥合用，祛風清熱、行氣活血。前期研究證實，祛風活血丸治療葡萄膜炎臨床療效確切[9-10]。

Th17細胞通過分泌炎性因子來介導葡萄膜炎的發生和發展[15]。Th17細胞主要通過特異性分泌炎性因子IL-17來介導促炎癥反應。JAK2/STAT3信號通路是一條與Th17分化、IL-17的合成分泌密切相關的重要炎性信號通路，信號通路的異常活化導致Th17分化、IL-17合成分泌異常。IL-23對于Th17的存活和功能具有維持作用，IL-17的分泌和Th17的分化、擴增均需要IL-23的誘導刺激。IL-23信號需經由JAK/STAT信號通路的轉導，JAK2、STAT3是這一信號通路的主要調節因子，IL-23與IL-23受體結合后，經由JAK/STAT通路磷酸化STAT3[5-6，16]。STAT3在Th17的分化、IL-17的合成和分泌過程中具有重要作用，而STAT3的功能只有通過JAK2使其磷酸化才能被啟動，所以JAK2與STAT3密不可分。因此，目前葡萄膜炎的治療思路更趨向于通過抑制調節因子JAK2和STAT3的表達，拮抗JAK2/STAT3信號通路的異常活化，良性調控Th17細胞的分化過程，抑制炎性因子的分泌，達到減輕炎癥反應的目的。

本次研究通過建立實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型，觀察了祛風活血丸對其視網膜JAK2/STAT3信號通路基因表達的調節作用。結果顯示：與模型組比較，祛風活血丸常規劑量組、祛風活血丸兩倍劑量組、熊膽開明片組JAK2 mRNA、STAT3

mRNA表達均降低，其中祛風活血丸兩倍劑量組JAK2 mRNA表達顯著降低。本實驗中祛風活血丸能抑制EAU大鼠視網膜組織中JAK2、STAT3 mRNA表達，說明了JAK2、STAT3是祛風活血丸干預EAU的靶點，即可通過抑制JAK2、STAT3靶點達到改善EAU病理過程的目的。綜上所述，祛風活血丸可能通過抑制JAK2、STAT3 mRNA表達水平，良性調控JAK2/STAT3信號通路，達到抗炎作用。

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