致石飼料致動物膽固醇結石模型造模要素及中醫藥防治的數據挖掘

張純 徐曉娟 王張 鄧蒂斯 李宛靜 雒芙蓉 梁小青 張淼

摘要目的：定量研究致石飼料致膽固醇結石動物模型的造模要素，為提高造模效率及評價藥物有效性提供方法學參考。方法：選取1993—2016年期間研究致石飼料致膽固醇結石動物模型的文獻，錄入動物種別、致石飼料配方、成石率、測試指標、受試藥物等重要信息，定量統計和分析造模要素。結果：常用豚鼠、小鼠、兔等動物；致石飼料常用膽固醇、脂肪等，其中豚鼠最常用的致石飼料配方為9000%全價飼料、1%膽固醇、2%豬油、5%蔗糖和2%酪蛋白，連續喂養49 d，成石率平均為8740%；小鼠最常用的配方為8350%全價飼料、1%膽固醇、15%脂肪、05%膽酸，連續喂養45 d，成石率平均為8948%；兔最常用的配方為9880%全價飼料、12%膽固醇，連續喂養50 d，成石率平均為7240%；犬喂食含03%膽固醇的致石飼料，連續42 d，成石率為100%；樹鼩喂食含膽固醇20%、蔗糖20%、大油（豬油）15%、蛋黃20%、玉米粉25%的致石飼料，連續喂養42 d，成石率為100%；金黃地鼠喂食含葡萄糖743%、酪蛋白20%、食鹽5%、維生素05%和氯化膽堿02%的致石飼料，連續21 d，成石率為50%。常測試的指標為，膽汁中TC、TBIL、LDL、BA、PL、HDL等，血清中TC、TG、TBIL、LDL、BA、HDL、CKK等。造模的同時給藥，常用藥物包括鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸和中藥復方，涉及甘草、大黃、白芍、金錢草、柴胡、茵陳等77種藥材。結論：致石飼料常用于制造膽固醇結石動物模型，但配方及其成石率差異大、成本高、耗時長，中醫藥有利于肝膽系統功能恢復，防止成石性膽汁的產生，評價指標主要涵蓋脂質、肝功能及膽道動力學等。

關鍵詞致石飼料；膽固醇結石；動物模型；造模要素；數據挖掘

Study on the Model Elements and the Data Mining of Traditional Chinese Medicine

in Animal Model of Cholesterol Gallstone Caused by Stone Feed

Zhang Chun1， Xu Xiaojuan1， Wang Zhang2， Deng Disi1， Li Wanjing1， Luo Furong1， Liang Xiaoqing1， Zhang Miao1

（1 Clinical Medicine School， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610073， China；

2 College of Ethnomedicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

AbstractObjective：To conduct a quantitative study on the modeling factors of animal model of cholesterol gallstone induced by stone feed to provide references for improving the efficiency of modeling and evaluating the effectiveness of drugs. Methods：Literatures on animal models of cholesterol gallstone induced by stone feed published during 1993 to 2016 were collected， and the important information such as the animal species， the feed formulation， the rate of stone formation， the test indexes and the drugs were input. A quantitative statistics as well as an analysis of modeling elements were conducted. Results：The commonly used animals for test were guinea pigs， mice， rabbits and stone feed commonly adopted cholesterol and fat. One of the most commonly used feed formulation for guinea pigs was 90% complete feed， 1% cholesterol， 2% lard， 5% sucrose and 2% casein and after a 49day continuous feeding， the stone formation rate was 8740% The most commonly used formula for mice was 8350% complete feed， 1% cholesterol， 15% fat， and 05% cholic acid. After a 45day continuous feeding， the average rate of stone formation was about 8948%. The most commonly used formula for rabbits was 9880% complete feed， 12% cholesterol and after a 50day continuous feeding， the average rate of stone formation was about 7240%. Dogs fed with 03% cholesterol stone feed for 42 consecutive days showed a 100% stone formation rate. Tree shrews fed with 20% cholesterol， 20% sucrose， 15% lard （lard）， 20% egg， 25% corn flour for 42 days also showed a 100% rate of stone formation while the hamster glucose fed with 743% casein， 20%， salt 5%， vitamin 05% and 02% choline chloride lithogenic diet for 21 consecutive days showed a 50% stone formation rate. The indicators of the test included TC， TBIL， LDL， Ba， PL， HDL， etc and serum TC， TG， TBIL， LDL， Ba， HDL， CKK， etc. Drugs were given in the process of modeling and the commonly used drugs included chenodeoxycholic acid， ursodeoxycholic acid， and compound Chinese Medicine which contains 77 kinds of medicinal herbs such as Radix Glycyrrhizae， Radix et Rhizoma Rhei， Radix Paeoniae Alba， Herba Lysimachiae， Radix Bupleuri， Herba Artemisiae Scopariae and so on. Conclusion：Stone feed is generally used in the manufacture of cholesterol gallstone animal model， but the formulation and the rate of stone formation often vary with a high cost and a timeconsuming process. Traditional Chinese medicine plays a positive role in recovering the functions of hepatobiliary systems and preventing cacocholia. The evaluation indexes mainly include lipid， liver function and biliary dynamics.

Key WordsStone feed； Cholesterol calculus； Animal model； Modeling elements； Data mining

中圖分類號：R282文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.058

膽囊結石是消化系統常見疾病，近年來發病率逐步增加[1]，其中約75%為膽固醇結石，其余主要為膽色素結石[2]。目前認為其形成的基礎為總膽固醇（TC）、膽汁酸（BA）及卵磷脂（LC）等成分比例失調，導致膽固醇從膽汁中析出凝結成晶發病。膽固醇結石的治療以手術為主，尤其是腹腔鏡膽囊切除術，是治療膽囊結石患者的首要選擇。在藥物治療上，最常用熊去氧膽酸（UDCA），能增加膽汁酸鹽在膽汁中的濃度，導致膽汁酸成分變化，促進膽固醇型結石逐漸溶解。與西藥比較，中藥能從多方面、多層次作用于肝細胞及膽道系統，常用柴胡、甘草、芍藥、金錢草、延胡索、香附等，通過疏肝解郁，清熱祛濕，利尿通淋等功效防治膽固醇結石的產生。

目前常用的膽固醇結石造模方法為致石飼料誘導法，成分為動物全價飼料加上不同百分比的TC、脂肪及BA等，其原理為模仿人體內膽固醇型膽結石生成機制。研究表明通過喂飼致石飼料形成膽固醇結石的過程與人類膽固醇結石發生、發展的過程接近，具有操作簡便、無手術創傷、便于觀察等優點[3]，但是各文獻報道的致石飼料配方多樣、成功率參差不齊，又因該模型的造模成本高、耗時長，故我們對國內20多年來利用致石飼料制造膽固醇結石模型的造模要素及其中醫藥防治的實驗研究結果進行數據挖掘和分析，為提高造模效率及評價中醫藥防治膽固醇結石的療效提供定量的方法學參考。

1資料與方法

11文獻來源在中國知網（CNKI）中，收集1993—2016年期間（24年）研究致石飼料致膽固醇結石動物模型的文獻。

12檢索策略通過CNKI進行高級論文檢索，輸入文章題目致石飼料致膽固醇結石動物模型的造模，檢索1993—2016年相關文獻檢索。

13納入標準收集研究致石飼料致膽固醇結石動物模型的文章納入本研究，最后篩選出符合研究所需的文獻57篇。

14排除標準臨床膽結石研究、動物膽色素結石實驗研究、植入結石研究等文章不納入本研究。

15數據的規范與數據庫的建立

151數據庫的建立制作《致石飼料致膽固醇結石動物模型的造模要素挖掘數據表》。

152數據庫的規范應用Excel軟件，錄入每篇文章題目，雜志名稱，出版年度，第一作者、通信作者及其所在地區，實驗動物種別、性別、購置時體重，致石飼料配方、給予量、造模天數、成石率，受試藥物名稱、藥物組成、陽性藥、給藥天數，成石率、結石位置和概況，測試指標等信息。

16數據分析對錄入的每項數據進行統計和分析，定量歸納造模要素。

2結果

本研究涉及全國20個省市的研究單位，其中研究單位最多的是北京、上海、廣州，分別為2031%、1406%、938%。可能與當地經濟水平發達，飲食結構中脂肪的攝入比例較高，繼而膽固醇結石發病率較高有關，另外亦與這些地區的科研單位較多有關。

21動物情況

211動物種別及其使用頻率依次為豚鼠（4098%）、小鼠（2787%）、兔（2622%）、犬（164%）、金黃地鼠（164%）和樹鼩（164%）。早期用豚鼠和兔比較多，近年來小鼠使用頻率增多，可能與小鼠的飼養成本較低有關。

212人類雌性患膽固醇結石的概率高于雄性[4]，因雌激素可升高TC水平，進而使膽固醇過飽和析出結晶引起結石。但文獻中多使用雄性，可能是為了排除雌性動物體內雌激素對膽固醇結石形成的促進作用。

213雄性豚鼠的體重為180～300 g，雌性為200～320 g；小鼠的體重為18～22 g；兔的體重為18～30 kg；雄性犬的體重多為2～3 kg；雄性金黃地鼠的體重為80～130 g；樹鼩的體重為180～200 g。

22造模結果

221豚鼠1）致石飼料配方24篇文獻共記載了15種致石飼料配方（表1）其中成分按照使用頻率由高到低依次為豚鼠全價飼料、膽固醇、脂肪、蔗糖、酪蛋白、膽酸、纖維素及其他（如甲基硫氧嘧啶等）。常用配方為豚鼠全價飼料（9000%）、膽固醇（1%）、豬油（2%）、蔗糖（5%）和酪蛋白（2%），給予豚鼠49 d后，平均成石率高達8740%。膽固醇為必需成分，其在致石飼料中的比例按照使用頻率由高到低依次為1%、15%、12%、2%、05%、005%、01%、125%。2）給藥周期平均52 d（標準差為1627 d），僅有8篇文獻記載了給予量，多為每只40 g/d只和每只100 g/d，亦有每只30 g/d和50 g/d。3）成石率及結石外觀模型組的平均成石率為8559%（標準差為111%）。膽結石主要位于膽囊內，為黃褐色不規則的顆粒狀或為膽石泥砂或為膽固醇鈣鹽結晶。

222小鼠1）15篇文獻共記載了5種致石飼料配方（表2），其成分按照使用頻率依次為小鼠全價飼料、膽固醇、脂肪、膽酸、蔗糖、酪蛋白、纖維素及其他（如復方鹽）。常用配方為小鼠全價飼料（8350%）、膽固醇（1%）、脂肪（15%）、膽酸（或膽汁酸、豬膽鹽）（05%）。膽固醇（或雙氫膽固醇）、脂肪、膽酸（或膽汁酸、豬膽鹽）為必需成分；其中，膽固醇使用頻率由高到低依次為1%、2%、125%、05%。2）致石飼料給予周期和致石率給予周期平均為51 d（標準差為9 d），模型組的成石率平均為929%（標準差為714%）。

223兔1）16篇文獻共記載了5種致石飼料配方（表3），其成分按照使用頻率依次為兔全價飼料、膽固醇、豬油、膽酸及其他（如蛋黃）。常用配方為兔全價飼料（9880%）、膽固醇（12%），膽固醇為必需成分，其在致石飼料中的比例按照使用頻率由高到低依次為12%、1%、15%、2%。2）致石飼料給予周期和成石率給予周期平均為31 d（標準差為714 d）；模型組的成石率平均為8583%（標準差為1639%）。

224犬李秋榮等[58]喂食犬含03%膽固醇致石飼料，喂食42 d的成石率為100%，膽囊內可見色澤呈黃白和黑褐色的多發性結石。

225樹鼩魏克強等[59]喂食致石飼料，其中含膽固醇20%、蔗糖20%、大油（豬油）15%、蛋黃20%、玉米粉25%，連續喂養42 d，成石率為100%。

226金黃地鼠傅德良等[64]喂食致石飼料，其中含葡萄糖743%、酪蛋白20%、食鹽5%、維生素05%和氯化膽堿02%。26只動物第3周起有結石形成，其中13只的膽囊內有明顯的結石形成。

23評價指標

231數據挖掘發現（表4），動物長期喂食膽固醇致石飼料后，膽汁中的TC、CSI、Ca、TBIL、MCP、DBIL、IBIL、BS、LDL、TP均上升，BA、PL、TBA、HDL、CG、LC均下降。膽汁中的膽鹽是重要的表面活性劑，與TC及PL以簡單膠團或復合膠團形式存在于膽汁中[60]，是膽結石形成的重要基礎之一，膽紅素與鈣形成膽紅素鹽，在膽汁環境中，肝臟分泌的蛋白質與膽囊分泌的MCP失去活性，通過化學鍵或靜電作用，與膽紅素鹽及膠體形成網架基質，從而形成膽結石。在膽汁環境中，LC與BA分別形成微膠粒，能夠使脂肪和TC乳化成對人體無害的微膠粒，一定比例的PL、BA、TC能夠在水中均勻分散，防止膽結石形成[61]。HDL及LDL主要在肝臟中分泌，主要承擔TC的轉運及TC的清除，因而防止膽結石發生，LDL的功能是將肝臟中的TC運輸到各個組織，當TC在細胞內聚集時，LDL的表達和激動將會被抑制，進而促進TC的堆積[62]。

232數據挖掘發現（表5），動物長期喂食膽固醇致石飼料后，血清中的TC、TG、TBIL、ALT、AST、TL、LDL、non HDL C、IL2、MDA、APN activity、APN Mrna、TBA、HDL2、HDL3、ApoCⅡ、P、VLDL、IL1β、TP、βLp、MUC1、MUC2、MUC3、GCA、GLU、SBIL、BUN均上升，HDL、SOD、ApoAⅠ、CKK、GIR、TCA、BA均下降。血脂代謝水平異常是膽囊膽固醇結石形成的重要因素[63]。血清中高密度脂蛋白（HDL）的降低和低密度脂蛋白（LDL）的升高是膽汁膽固醇的重要來源，攝入過多的TC會導致血清中TC增高，而膽汁中的TC又與血清中TC密切相關[64]。從數據挖掘結果可知，血清中TG、TC的濃度過高更易發生膽結石，其機制可能與上述一致。膽汁主要由肝臟分泌，肝臟的損傷會導致蛋白分泌失調，促使結石發生，ALT、AST是肝臟功能的重要檢測指標，其上升提示肝臟功能損傷。IL6、ILβ1表達升高是由膽汁細菌感染導致的炎性遞質釋放過量，提示細菌感染也是導致膽結石發生的原因之一，CKK的下降則會導致膽汁的淤積從而引發膽結石。

表4致石飼料致膽固醇結石動物模型膽汁中測指標測試指標模型組指標變化篇數用藥組指標變化篇數總膽固醇（TC）↑32↓21膽汁酸（BA）↓10↑8磷脂（PL）↓9↑8膽固醇飽和指數（CSI）↑8↓6鈣（Ca）↑6↓5總膽紅素（TBIL）↑6↓5黏蛋白（MCP）↑6↓4總膽汁酸（TBA）↓5↑6直接膽紅素（DBIL）↑4↓4間接膽紅素（IBIL）↑2↓2膽鹽（BS）↑2↓2高密度脂蛋白（HDL）↓2↑2低密度脂蛋白（LDL）↑2↓2肝膽酸（CG）↓1↑1卵磷脂（LC）↓1↑1總蛋白（TP）↑1↓1

233其他指標在促成石成分中，除黏蛋白由膽囊上皮分泌外，其余大部分均來源于肝臟。肝臟是膽汁的主要來源，膽汁的分泌和形成主要由肝細胞完成，肝臟是TC合成及向BA轉化的重要器官。喂食高膽固醇致石飼料后測得肝Scp2、肝臟質量、膽囊長徑、膽囊體積、膽汁容積、膽固醇膽鹽比等升高，肝膽汁磷脂比值、肝膽汁總膽汁鹽、CCK受體mRNA、BUGT等均下降，促進膽固醇結石形成。

24藥物防治

241采用預防性給藥的方式，即在造模的同時給藥，有利于減少實驗周期，提高研究效率。給藥周期平均為49 d（標準差為15 d），與臨床長期給藥的情況類似。

表5致石飼料致膽固醇結石動物模型血清中的測試指標測試指標模型組指標變化篇數用藥組指標變化篇數總膽固醇（TC）↑43↓30三酰甘油（TG）↑15↓12高密度脂蛋白（HDL）↓6↑4總膽紅素（TBIL）↑5↓2谷丙轉氨酶（ALT）↑3↓3谷草轉氨酶（AST）↑3↓2總脂（TL）↑3↓3低密度脂蛋白（LDL）↑2↓2非高密度脂蛋白膽固醇

（non HDLC）↑2↓2白細胞介素2（IL2）↑2↓2丙二醛（MDA）↑2↓2超氧化物歧化酶（SOD）↓2↑2脂聯素（APN activity）↑2↓2脂聯素Mrna（APN Mrna）↑2↓2總膽汁酸（TBA）↑2↓2高密度脂蛋白2（HDL2）↑2--高密度脂蛋白3（HDL3）↑2--載脂蛋白C Ⅱ（ApoCⅡ）↑1--磷脂（P）↑1↓1極低密度脂蛋白（VLDL）↑1↓1白細胞介素1β（IL1β）↑1↓1血清總蛋白（TP）↑1↓1β脂蛋白（βLp）↑1↓1（MUC1）黏蛋白基因（MUC2）↑1↓1（MUC3）甘氨膽酸（GCA）↑1↓1載脂蛋白A Ⅰ（ApoA Ⅰ）↓1--血漿膽囊收縮素（CKK）↓1↑1胰島素抵抗（GIR）↓1↑1牛磺膽酸（TCA）↓1↑1血糖（GLU）↑1↓1血清（SBIL）↑1↓1血漿尿素氮（BUN）↑1↓1膽汁酸（BA）↓1↑1

242陽性對照藥組的成石率平均為1927%（標準差為174%），能明顯預防結石的形成。常用鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸，通過降低膽汁膽固醇的分泌使膽汁去飽和，不飽和膽汁則具有溶解膽固醇的作用，使膽石表面的膽醇分子不斷地被溶解，膽石體積逐漸縮小以至完全溶解。

243能減輕膽囊炎性反應，提高膽囊的收縮功能，降低膽囊結石的成石率。藥物組的平均成石率為2437%（標準差為1564%），57篇文章中使用中藥復方23個，即大柴胡湯[13]、膽石六號湯劑[27]、利膽排石湯[33]、消炎利膽湯[11]、疏肝利膽湯[46]、膽囊Ⅲ號方[26]、中藥排石方[56]、含28種中藥的復方[9]、消石散[61]、茵陳合劑[57]、金錢對唑合劑[24]、養肝利膽顆粒[6]、益膽顆粒[55]、膽病顆粒[4]、舒膽通顆粒[18]、利膽排石沖劑[16]、膽寧片[15]、防石膠囊[25]、大黃靈仙膠囊[37]、膽石消膠囊[38]、肝膽寧[15]、舒肝順氣丸[23]、小檗堿[53]。

24477種，即（括號內為使用頻率）甘草（3889%），大黃（3611%），白芍（3333%），金錢草（3333%），柴胡（3056%），郁金（2778%），延胡索（2222%），茵陳（1944%），香附（1944%），枳實（1944%），雞內金（1667%），木香（1667%），黃芩（833%），芒硝（833%）等。現代藥理研究表明，甘草具有降脂、保肝的作用；大黃可促進膽汁分泌，并使膽紅素和膽汁酸含量增加；金錢草可以促進膽汁的分泌。中藥配伍具有利尿通淋，解毒消腫，祛瘀止痛，利膽退黃的功效從而防治膽固醇結石，常見的藥對如：1）柔肝緩急止痛用白芍、甘草；2）利尿通淋利石用金錢草、大黃；3）和解表里用白芍、柴胡；4）清泄肝膽之熱用柴胡、黃芩；5）理氣解郁用郁金、枳實；6）醒脾開胃用雞內金、木香；7）瀉下通便用大黃、芒硝。

245有效性評價指標膽汁中指標BA、LC、PL、TBA、HDL等均升高，TC、CSI、TBIL、LDL等均下降，血清中BA、HDL、CKK等均升高，TC、TG、ALT、AST、LDL等均下降，其他指標膽囊收縮頻率、CKK、BUGT等表達升高，肝Scp2、肝臟質量、膽囊體積等下降，均有利于防治膽固醇結石的形成。

3討論

膽結石屬于中醫學“肝脹”“膽脹”“脅痛”的范疇。肝性剛強，性喜調達惡抑郁，因此肝氣、肝陽常為有余，肝陰、肝血常為不足。元代李杲提出脅痛的主要病機是肝木妄行，肝與脾均位于中焦，肝主疏泄影響脾胃的運化，故肝膽患病易傳于脾，致脾之運化水谷及水濕功能異常，脾虛不能升清，水谷停滯于中焦，生熱蘊濕，氣機阻滯，造成肝膽的疏泄失常，膽汁淤積而形成結石[66]。因此中醫治療該病從肝論治，治法疏肝利膽，清熱祛濕，排石通淋。中醫用藥，主要目的不是將結石溶解或者排除，而是減少致石因素、減輕炎性反應和疼痛等。

現代醫學研究表明，肝臟分泌異常引起膽汁成分變化，使膽固醇的過飽和結晶析出，是導致膽固醇結石形成的一個重要條件[65]。評價指標主要涵蓋脂質、肝功能及膽道動力學等方面，因此，治療膽固醇結石的關鍵是恢復肝膽系統的正常功能，防止成石性膽汁的產生。

致石飼料制造膽固醇結石動物模型，雖然十分常用，成石率也較高，但是文獻報道的致石飼料配方差異大、成功率參差不齊，再加上成本高、耗時長，導致開展相關研究的效率不高。故我們收集歸納總結國內近24年有關動物膽固醇結石造模與中醫藥防治的文獻，開展膽固醇結石動物模型造模要素挖掘研究，可精準把握造模要素，提高造模的成功率，對膽固醇結石的有效性評價具有一定的參考和指導價值。

但是，本研究存在不足之處，如文獻的研究質量未加區分，有的作者在造模方面未透露造模飼料具體配方，在治療上未羅列復方中中藥的組成及劑量，甚至存在真實性問題等問題，進而導致數據結果的科學性稍顯不足。

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