繭絲腐化液微生物群落分析及脫膠功能菌的篩選

李丹　程明　方佳　李喬蘭　吳重德　周榮清

摘要： 為了選育穩定高效的繭絲脫膠菌株，文章首先利用PCRDGGE技術對繭絲腐化液微生物群落結構進行了解析，研究結果表明，腐化液的優勢菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）。對腐化液中脫膠微生物進行了篩選，獲得了一株脫膠率較高的菌株，經16S rDNA分子鑒定，命名為Aeromonas sp. TJ5。對脫膠菌株脫膠條件進行了優化，獲得了最適的pH值、溫度和接種量，分別為pH7.0、37℃和3%。在優化的培養條件下發酵48h，脫膠率達到28.2%，蛋白酶活力為59.5U/mL。研究結果為建立繭絲的微生物純種發酵工藝奠定了基礎。

關鍵詞： 脫膠；微生物群落；氣單胞菌；腐化液；分離鑒定

中圖分類號： TS195.2文獻標志碼： A文章編號： 10017003（2018）04000106引用頁碼： 041101

Abstract： In this study， to screen stable and highactivity strains for silk degumming， microbial community structure of silk natural fermentation liquid was firstly investigated by PCRDGGE technology， and the results showed that the dominant genus was Bacillus. Screening of degumming microorganism possessing from silk natural fermentation liquid was performed， and a bacterium with high degumming rate was obtained. The bacterium was named Aeromonas sp. TJ5 based on 16S rDNA molecular identification. The degumming conditions of TJ5 were optimized， and the optimal pH， temperature and inoculum concentration were pH 7.0， 37℃， and 3%， respectively. After cultivation for 48h under the optimal conditions， the degumming rate and protease activity reached 28.2% and 59.5U/mL， respectively. These results may contribute to developing a new degumming process for pure microbial fermentation.

Key words： degumming； microbial community； Aeromonas； silk natural fermentation liquid； isolation and identification

繭絲由絲素和絲膠構成，分別占繭絲含量的70%～80%和20%～30%[12]。由于絲膠過多會影響蠶絲的光澤和手感，通常需要將過量的絲膠脫除。在養蠶、制絲及絲織行業還將剔選出大量不適合繅絲的下繭、工業廢絲及下腳料成為絹紡原料。這些原料含有大量絲膠、油脂、雜質等，必須通過工藝處理脫除大部分膠質、油脂等。目前絹紡工業脫膠常用的方法有化學法和腐化化學法。化學脫膠主要利用堿溶液進行煮練，缺點是化學試劑用量大、污染環境嚴重、耗水、耗能、脫膠不均勻、對纖維損傷大[34]。腐化法又稱生物法，是一種自然發酵法。利用自然形成的微生物體系進行生物脫膠，作用溫和、污染少[5]。但由于是混菌發酵，微生物群落結構復雜，發酵過程不易控制，產品質量不穩定。如果能從腐化液中篩選具有脫膠能力的菌株，然后采用純種發酵的方式進行脫膠，既可以減少雜菌污染，同時可以提高脫膠效率并穩定產品品質。近年來，許多研究者從腐化液中分離篩選出高效脫膠菌株，利用純種微生物或微生物產生的酶進行脫膠，取得了良好效果[1，68]。本文利用PCRDGGE技術對繭絲腐化液微生物群落進行研究，從腐化液中篩選具有脫膠功能的菌株，并分析菌株脫膠性能，研究結果為絹紡原料的微生物脫膠奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料

繭絲及腐化液（四川省南充銀海絲綢有限公司）。

1.1.2主要試劑和儀器

土壤總DNA提取試劑盒（美國OMEGA公司），2×PCR Master Mix和PCR產物純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司），瓊脂糖、丙烯酰胺、N，N甲叉丙烯酰胺、甲酰胺、TEMED、SYBR Green I染料（成都博瑞克試劑有限公司），其他試劑均為分析純。

BioRad S1000PCR儀、水平電泳儀及DGGE儀、GEL Doc+凝膠成像儀（美國BioRad公司）。

1.1.3培養基

1）種子培養基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0，0.1MPa滅菌20min；

2）篩選培養基：酪素4g/L，硫酸銨3g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鈉1.5g/L，氯化鈉1g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，pH7.0，0.1MPa滅菌20min；

3）脫膠培養基：硝酸銨1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鈉1.5g/L，氯化鈉1g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，pH7.0，0.1MPa滅菌20min。

1.2方法

1.2.1繭絲腐化液總DNA的提取

準確量取80mL廢水樣品，離心（10000r/min、4℃）10min，收集沉淀，重懸于25mL磷酸緩沖液（PBS、0.05mol/L、pH8.0）中，漩渦混勻5min，再低速（800r/min、4℃）離心10min，收集上層懸濁液。加入25mL相同的PBS離心（800r/min、4℃）洗滌沉淀物2次，匯集收集的懸濁液，離心（10000r/min、4℃）分離10min，收集沉淀物。

將收集到的細菌沉淀用土壤總DNA提取試劑盒提取樣品總DNA。根據試劑盒說明書提取DNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的大小及純度；提取的總DNA置于-20℃冰箱中保藏待用。

1.2.2PCR擴增

參考文獻[9-10]中所述方法，采用巢式PCR方式進行，擴增引物及擴增條件如表1所示。擴增體系為50μL︰2×Taq Master Mix25μL，正反引物各2μL（10mM），模板2μL，ddH2O 19μL。

1.2.3DGGE分析

DGGE采用8%的膠濃度，變性劑濃度梯度為30%～60%，每一泳道載樣量為80μL。DGGE分析在Dcode通用基因突變檢測系統中進行，在60℃、150V條件下，電泳5h。電泳結束后，DGGE凝膠用SYBR Green I染色30min，隨后在GEL Doc+凝膠成像儀中成像。將得到的DGGE條帶進行切膠回收，置于1.5mLEP管中，搗碎并用40μL ddH2O浸泡，4℃下靜置過夜。取2μL過夜后的上清液作為模板，進行第二輪的PCR擴增，將產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行后續的克隆及測序。

1.2.4脫膠微生物的分離及篩選

吸取1mL繭絲腐化液至含有9mL無菌水的EP管中，振蕩分散后，梯度稀釋涂布于牛種子（固體）培養基平板中，30℃培養24h。隨機挑選單菌落經劃線分離為純菌落，接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養基中培養。

初篩：將上述挑選的單菌落點種于篩選培養基平板上，置于30℃培養箱中培養24h。根據菌落周圍的透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比（D/d），選出比例較大的菌株進行下一步篩選。

復篩：將初篩獲得的菌株活化，接種至裝有100mL脫膠培養基的250mL三角瓶中，置于30℃培養箱中脫膠培養48h，脫膠完成后，將繭絲樣品取出、沖洗干凈，再放入干燥箱中恒重。根據脫膠處理后繭絲損失的質量來篩選出最佳的脫膠菌種。

1.2.5菌株16S rDNA鑒定

離心收集培養至對數生長后期的菌體，采用Bacterial DNA Kit試劑盒提取菌株總DNA。采用細菌通用引物27f和1492r（表1）對總DNA進行PCR擴增，擴增產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將測序得到的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數據庫做相似性分析。

1.2.6菌株脫膠條件的優化

分別考察了培養基初始pH值、培養溫度和接種量對菌株脫膠效率的影響。pH值對脫膠的影響：將脫膠培養基的pH值分別調至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按1%的接種量接種菌株TJ5，加入1g繭絲樣品，置于30℃培養箱中培養48h，測定繭絲脫膠率；溫度對脫膠的影響：按1%接種量向脫膠培養基中（pH7.0）接入菌株TJ5，并加入1g繭絲樣品，將其分別置于20、25、30、37、42℃恒溫培養箱內培養48h，測定繭絲脫膠率，獲得最優的脫膠溫度；接種量對脫膠率的影響：分別按1%、2%、3%、5%、7%的接種量將菌株TJ5接種至脫膠培養基中（pH7.0），加入1g繭絲樣品，將其置于37℃恒溫培養箱內培養48h，測定脫膠率，獲得菌株的最優接種量。

1.2.7繭絲含水率的測定

準確稱取1g繭絲，放入烘箱中105℃烘干至恒重，計算繭絲含水率：

1.2.9蛋白酶活力測定

堿性蛋白酶活力的測定按照Raval等[12]和Patel等[13]的方法進行。一個酶活力單位表示為1mL酶液在40℃、pH3.0的條件下，1min水解酪素產生1μg酪氨酸定義為一個酶活力單位。

2結果與分析

2.1繭絲腐化液微生物群落結構分析

利用PCRDGGE技術對繭絲腐化液細菌微生物群落進行了研究，結果如圖1所示。從圖1可以看出，通過電泳獲得多條清晰的條帶。將優勢度較高及光密度值較大的條帶切膠回收、PCR擴增及克隆測序，測序結果與NCBI數據庫中的基因序列進行比對，結果如表2所示。

細菌測序結果表明，共檢出鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonadaceae）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭狀菌屬（Clostridium）3個屬的細菌，其中優勢菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus），共有11條譜帶檢測為芽孢桿菌屬，豐度最高的菌為Bacillus sp.（Band 11）。而PCR圖譜中優勢度較高的5條譜帶即譜帶2、譜帶3、譜帶4、譜帶7和譜帶8，鑒定結果都為蠟樣芽孢桿菌。分析結果表明，芽孢桿菌（Bacillus）為繭絲腐化液中的優勢菌。楊雪霞等[14]利用可培養的方法對絹紡腐化液的微生物群落進行了分析，研究結果表明腐化液的主要微生物為細菌，濃度為1.34×107個/mL，研究中未檢測到真菌和放線菌，原因可能是腐化液的pH值為6.5～7.0，不適合真菌及放線菌的生長。近年來，許多研究人員從繭絲腐化液中篩選出多株具有脫膠性能的細菌，多為芽孢桿菌屬。Suwannaphan等[1]從繭絲脫膠廢水中篩選獲得一株產絲氨酸蛋白酶的脫膠菌株Bacillus sp.，該酶能完全除去絲膠。而且在長時間作用過程中不破壞絲心蛋白。單世寶等[5]從蠶絲腐化液中篩選獲得一株具有脫膠功能的菌株，命名為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus D7，為建立蠶絲的純種微生物發酵脫膠工藝奠定了基礎。

2.2脫膠功能菌的篩選鑒定

以繭絲腐化液為研究對象，利用透明圈法從酪素瓊脂培養基中挑取透明圈直徑與菌落直徑之比（D/d）較大的單菌落，共分離獲得122株潛在的脫膠菌株。將菌株分別接種至脫膠培養基中進行進一步篩選，以脫膠率為基準，篩選獲得脫膠率較高的菌株10株。將這10株菌株再接種至脫膠培養基中進行復篩，結果如表3所示。從表3可以看出，菌株TJ5脫膠率最高，達到18.6%左右。

菌株TJ5經活化后，提取基因組DNA，擴增獲得其16S rDNA核苷酸序列，全長為1507 bp，在GenBank中登錄號為MF465784，將該16S rDNA基因序列與NCBI中的DNA序列進行比對，得到10株有100%同源性的菌株，系統發育樹中菌株TJ5（圖2）與Aeromonassanarellii LMG 24682屬于同一分枝，確定該菌株為氣單胞菌屬（Aeromonas），命名為Aeromonas sp. TJ5。

2.3功能菌脫膠條件的優化

傳統的絹紡原料微生物脫膠通常采用自然發酵法，腐化液循環使用，能夠快速啟動發酵，縮短發酵周期，在采用微生物純種培養脫膠時，需要對微生物脫膠的工藝條件進行優化。實驗首先考察了培養基初始pH值對脫膠的影響，結果如圖3（a）所示，培養基初始pH值對脫膠率有較大的影響，當初始pH值為6.0時，脫膠率為9.8%，增加pH值，脫膠率逐漸增加，在pH值為7.0時，脫膠率最高達到21.5%，繼續增加pH值，脫膠率顯著下降。因此，選擇最適的初始pH值為7.0。微生物通常需要在一定的pH值環境中才能正常的生長、代謝和繁殖，如果pH值不合適，不但會妨礙微生物的正常生長繁殖，而且會改變微生物的代謝途徑和代謝產物的性質。單世寶等[15]篩選了一株蠶絲脫膠菌，并對脫膠工藝進行了優化，結果表明，在pH值7.0時，蠶絲的殘膠率最低，發酵液蛋白酶活力最高，分別達到5.23%和22.32U/mL。

圖3（b）考察了溫度對脫膠的影響，結果表明，升高溫度脫膠率逐漸增加，當溫度為37℃時，脫膠率最高，達到24.2%，繼續增加溫度，脫膠率顯著降低。這主要由于溫度影響細胞生長及酶的活性，研究結果與以前的報道一致[5]。

圖3（c）考察了接種量對脫膠的影響，隨著接種量的增加，繭絲脫膠率逐漸增加，當接種量為3%時，脫膠率最大，達到27.3%，繼續增加接種量，脫膠率反而下降。單純增加接種量并不能提高脫膠率，主要是由于營養物質的限制，使菌株的生長代謝受到影響，從而影響其代謝。因此，選擇接種量為3%進行后續實驗。

2.4菌株TJ5脫膠過程分析

在上述優化的發酵條件基礎上，考察了發酵過程中菌株生長、脫膠率及蛋白酶活力的變化（圖4）。從圖4可見，隨著發酵時間的延長，細胞生物量逐漸增加，在32h左右達到穩定；脫膠率和蛋白酶活力在發酵前期沒有明顯的變化，到對數期后，脫膠率和蛋白酶活力逐漸增加，可見蛋白酶的產生與絲膠的減少密切相關。結果顯示，發酵48h，蛋白酶活力達到59.5U/mL，脫膠率達到28.2%。

3結論

繭絲腐化液是由多種微生物組成的混菌體系，微生物群落結構復雜，本文利用PCRDGGE技術對腐化液的微生物群落結構進行了解析，獲得了繭絲腐化液的微生物群落組成；利用酪蛋白平板初篩和發酵脫膠復篩進行了脫膠功能菌的篩選，獲得了一株能有效降低繭絲膠質的菌株TJ5，通過16S rDNA序列分析，對菌株進行了鑒定，命名為Aeromonas sp. TJ5。通過對菌株的微生物脫膠工藝進行優化，獲得了最適的脫膠工藝條件，為繭絲的微生物純種發酵脫膠奠定了基礎。

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