口蹄疫病毒熒光RT—PCR檢測試劑盒的篩選

凌洪權 黎朝燕 楊澤林 謝建華 董春霞 黃恒 鐘小艷 吳昌義

摘要：為了及時、準確地診斷口蹄疫疫情，避免誤診而造成重大的經濟損失，我們對5個不同生物技術有限公司（分別以A、B、C、D、E代替）生產的口蹄疫病毒通用型、O型、A型、Asia1型熒光RT-PCR檢測試劑盒進行了試驗對比，最終從通用型和3個分型試劑盒的靈敏性、交叉反應、反應體系、反應條件、反應速度、操作簡便性等方面篩選出了B公司的試劑盒相對優于其他4個公司的試劑盒。

關鍵詞：口蹄疫；試劑盒；篩選

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.004

口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）屬于微RNA病毒科（Picornaviridae）、口蹄疫病毒屬（Aphthovirus）的單股正鏈RNA病毒，含有7個型（O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3）和多種亞型[1]。能夠感染多種偶蹄動物，造成嚴重的經濟、政治和社會問題[2-3]。在我國以及非洲和亞洲的許多國家流行，其傳播速度快、感染率高，嚴重影響當地畜牧業的發展以及動物產品的國際貿易[4-5]。該病被世界動物衛生組織（OIE）列為必須通報的動物疫病，也是我國一旦發生必須上報的一類動物傳染病之首[6]。本試驗通過對5個生物技術有限公司提供的口蹄疫病毒試劑盒進行比較，旨在為及時、準確地處理口蹄疫疫情提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 抗原

口蹄疫病毒A型抗原、O型抗原、Asia1型抗原購自國家口蹄疫參考實驗室中國農業科學院蘭州獸醫研究所。

1.2 試劑

口蹄疫病毒通用型熒光RT-PCR檢測試劑盒、口蹄疫病毒O型熒光RT-PCR檢測試劑盒、口蹄疫病毒A型熒光RT-PCR檢測試劑盒、口蹄疫病毒Asia1型熒光RT-PCR檢測試劑盒購自 A、B、C、D、E 5個公司。

1.3 核酸提取試劑盒

核酸提取試劑盒（磁珠法）購自天隆科技生物技術有限公司。

1.4 方法

依據《口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測方法》GB/T 22915-2008。

2 結果

2.1 口蹄疫病毒通用型熒光RT-PCR試劑盒檢測結果表（見表1）

2.2 口蹄疫病毒O型熒光RT-PCR試劑盒檢測結果表（見表2）

2.3 口蹄疫病毒A型熒光RT-PCR試劑盒檢測結果表（見表3）

2.4 口蹄疫病毒Asia1型熒光RT-PCR試劑盒檢測結果表（見表4）

2.5 口蹄疫病毒通用型、O型、A型、Asia1型熒光RT-PCR試劑盒結果評比表（見表5）

評分和靈敏性指標：

操作簡便性：配制反應體系時，幾種同類試劑盒比較，最便捷得3分，中等得2分，最差得1分。

反應體系一致性：每個公司4種試劑盒配制體系時各個成分的量完全一致得3分，3種一致或2、2一致得2分，只有2種一致得1分，全都不一致得0分。

反應條件一致性：通用型與3種分型試劑盒的反應條件完全一致得3分，3種一致或2、2一致得2分，只有2種一致得1分，全都不一致得0分。

交叉反應：無交叉反應且增長趨勢好者得3分、增長趨勢一般者得2分、增長趨勢平緩者得1分；有交叉反應者得0分。

靈敏性：首先淘汰有交叉反應者，再根據CT值與平均值比較，CT值越小或越接近平均值且增長趨勢越好者靈敏性越高。

經過對5個公司口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒的比較，篩選出B公司的試劑盒相對于其他4個公司的試劑盒操作簡便、通用型與3個分型能在同一臺熒光PCR儀上同時完成（即反應條件一樣）、各個分型試劑盒無交叉反應、靈敏性較高等優勢，因此B公司的試劑盒是首選。

3 討論

口蹄疫診斷技術包括口蹄疫病毒的微量補體結合試驗、食道探杯查毒試驗、反轉錄一聚合酶鏈反應（RT-PCR），病毒中和試驗、液相阻斷一酶聯免疫吸附試驗、病毒感染相關抗原（VIA）瓊脂凝膠免疫擴散（AGID）試驗（適用于檢測各種不同樣品中的口蹄疫病毒抗原或抗體）[7]以及口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測方法（適用于動物及其動物產品中口蹄疫病毒的檢測）[8]。確診口蹄疫疫情時，一般都是檢測樣品中是否含有口蹄疫病毒，因此RT-PCR或熒光RT-PCR方法較為常用。RT-PCR方法相對比熒光RT-PCR方法較為復雜、耗時也長，所以熒光RT-PCR方法是確診疫情的首先方法。

由于口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒有諸多的優特點，因此市場上熒光檢測試劑盒猶如春筍般的涌現出來，生產廠家較多，但是檢測效果各異。為了準確地診斷疫病，在選用不同公司的試劑盒之前一定要做試驗比較，不能盲目地根據價格的高低而輕易選購，否則誤診會造成更大的經濟損失。

參考文獻

[1] 劉慶軍，張永光.口蹄疫病毒基因組結構及其功能[J].動物醫學進展，2005， 26（5）：1-5.

[2] Thomson G R， Vosloo W， Bastos A D S.Foot and mouth disease in wildlife [J].Virus Research，2003，91（1）：145-161.

[3] Grubman M J， Baxt B.Foot-and-mouth disease.[J].British Journal of General Practice the Journal of the Royal College of General Practitioners， 2001， 51（466）：417.

[4] Sobrino F， Domingo E.Foot-and-mouth disease in Europe.FMD is economically the most important disease of farm animals.Its re-emergence in Europe is likely to have consequences that go beyond severe alterations of livestock production and trade.[J].Embo Reports， 2001，2（6）：459-61.

[5] Domingo E，Baranowski E，Escarmís C，et al.Foot-and-mouth disease virus[J].Comparative Immunology Microbiology & Infectious Diseases，2002，25（5-6）：297.

[6] Baxi M K， Baxi S，Clavijo A， et al.Microarray-based detection and typing of foot-and-mouth disease virus.[J].Veterinary Journal，2006，172（3）：473-481.

[7] 王莉娟，徐天剛，趙云玲，等.口蹄疫診斷技術研究進展[J].中國畜牧獸醫， 2005，32（3）：41-44.

[8] 羅長保，魚海瓊，林志雄.應用熒光RT—PCR技術檢測口蹄疫病毒[J].中國獸醫雜志， 2003，39（12）：31.