豬亞洲I型口蹄疫免疫抗體檢測與分析

邵勝勇

摘要：口蹄疫是世界動物衛生組織（OIE）規定的A類烈性動物傳染病，我國列為一類動物傳染病?？谔阋吖灿?種血清型，亞洲I型是其中一種。目前，國內還沒有對豬亞洲I型口蹄疫進行強制免疫，我們通過2015-2017年對13958頭豬進行亞洲I型口蹄疫免疫抗體的檢測，旨在對本地區豬群通過免疫口蹄疫O型-亞I型疫苗產生的抗體進行監測，掌握群體免疫抗體水平，評價免疫疫苗的有效性，并對免疫效果進行總結，對生產中發現的問題進行分析，提出解決的對策。方法為：豬群在免疫口蹄疫O型-亞洲I型二價滅活疫苗28 d至4個月之間，免疫次數從一免至五免，采集豬血清，以亞洲I型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，定量檢測樣品抗體水品。通過分析檢測數據，得出如下結論：豬亞洲I型口蹄疫免疫抗體陽性率和抗體水平總體不高，但具備較好的保護力；商品豬免疫抗體陽性率和抗體水平均高于種豬；免疫抗體陽性率隨免疫次數增加呈逐漸上升趨勢，但四免后陽性率下降，到五免時則再次上升。通過檢測免疫抗體，分析其變化特征及規律，為豬亞洲I型口蹄疫的防控、研究及免疫提供依據。

關鍵詞：口蹄疫；亞洲I型；免疫抗體；檢測

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.002

1 方法

1.1 疫苗

疫苗均為口蹄疫O型-亞洲I型二價滅活疫苗，中牧實業股份有限公司蘭州生藥廠生產。

1.2 疫苗免疫及樣品采集

由于實際生產中不對豬進行亞洲I型口蹄疫單獨免疫，因此免疫程序均按照口蹄疫O型-亞洲I型二價滅活疫苗的免疫程序進行免疫，即仔豬30日齡時首免，1個月后二免，之后每4個月免疫1次。 所檢測血清樣品均為免疫后28天至4個月以內的樣品，免疫次數從一免至五免。無菌采集血液，經離心，分離出血清進行檢測。2015-2017年檢測樣品數分別為4689份、3314份、5955份，其中一免至五免樣品數分別為3455份、4905份、2234份、1784份、1580份，種豬檢測數6799份、商品豬檢測數7159份。

1.3 抗體檢測試劑盒

亞洲I型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，購自中國農科院蘭州獸醫研究所。

1.4 抗體檢測方法

亞洲I型口蹄疫抗體檢測液相阻斷ELISA方法，操作步驟如下：

1.4.1 稀釋血清

在U型反應板上，以50μL/孔的量用1×PBST將待檢血清從1：4開始做2 倍連續稀釋至1：512（即每列第一孔加入75μL1×PBST，再加入25μL被檢血清，其余7孔各加入50μL1×PBST），陽性對照血清從1：2稀釋至1：256，陰性對照血清從1：2稀釋至1：4。設病毒抗原對照孔4孔。

1.4.2 加病毒抗原

將病毒抗原用1×PBST稀釋至工作濃度，向被檢血清、陰陽性對照血清的每一稀釋孔內，各加入50μl，4孔病毒抗原對照孔各加入100μl。封板，振蕩，4℃靜置過夜或者37℃溫育90 min。

1.4.3 將U型反應板上的抗原抗體混合液按次序轉移到已包被口蹄疫亞洲I型兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，37℃溫育60 min。

1.4.4 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入口蹄疫亞洲I型豚鼠抗體工作液，封板，37℃溫育30 min。

1.4.5 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，封板，37℃溫育30 min。

1.4.6 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入底物溶液（務必加雙氧水，每1 ml底物溶液加入10μL3%雙氧水），封板，37℃溫育15 min，每孔再加50μL終止液終止反應，立即在492 nm波長下讀取光吸收值（D492 nm值）。

1.5 結果判定

1.5.1 試驗認可標準

每塊板設4孔抗原對照，病毒抗原對照D492 nm值應在1.5±0.5范圍內。陽性對照抗體效價應在1：1024±1滴度以內，陰性對照血清抗體效價應<1：8。

1.5.2 血清抗體效價判定

抗原對照4孔，棄去最高和最低D492 nm值，計算其余2孔的平均D492 nm值，再除以2，即50%對照值，該值即為臨界值，表示阻斷50%反應的對照D492 nm值。被檢血清D492 nm值大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的D492 nm值孔為陽性孔。若臨界值與稀釋倍數最高陽性孔的D492 nm值相同，則以被檢血清陽性孔的最高稀釋倍數作為該份血清的抗體效價；若臨界值處于兩個稀釋孔D492 nm值之間，抗體效價取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數的反對數中間值。抗體效價計算對照表見試劑盒使用說明書。

1.5.3 結果判定

參考該試劑盒規定的牛羊亞洲I型口蹄疫抗體效價同保護力的關系，即“抗體效價≥1：128，保護率99%”的標準，作為豬的免疫保護臨界線，即：抗體效價≥1：128判定為亞洲I型口蹄疫抗體陽性，抗體效價<1：64，判定為陰性，介于1：64～1：128時，判定為可疑。群體免疫抗體陽性率≥70%即表明該群體對亞洲I型口蹄疫具備免疫保護力。

2 結果

通過2015-2017年連續3年中檢測到的豬亞洲I型口蹄疫免疫抗體，3年檢測樣品13958份，整體平均免疫抗體陽性率為37.84%。按照年度逐月對檢測結果進行統計，免疫抗體陽性率如表1所示；2015-2017年平均抗體效價如表2所示。

按照養殖類型的不同，將檢測樣品按照種豬、商品豬進行分類統計，按年度計算免疫抗體陽性率及抗體效價，結果如下表3。

檢測樣品從免疫1次至免疫5次，統計各年份中所檢測樣品不同免疫次數下免疫抗體陽性率及抗體效價，得到表4所示結果。

3 分析與結論

統計3年的免疫抗體檢測結果（見表4），豬亞洲I型口蹄疫免疫抗體陽性率較低，整體平均為37.84%，平均抗體效價也較低，主要原因為，用于免疫的口蹄疫O型-亞洲I型二價滅活疫苗為牛源疫苗，用于豬的免疫，其免疫原性較低，不能產生很好的免疫應答。從實際生產情況看，豬患亞洲I型口蹄疫的癥狀及程度并不嚴重[1]。通過大量的檢測數據，雖然總體免疫抗體陽性率與免疫抗體效價均較低，但被檢測到的個體及其所在的群體并未發生亞洲I型口蹄疫，因此可以認為，在堅持對豬群實施免疫的情況下，豬只對亞洲I型口蹄疫是具備抵抗力的。按照種豬（后備種豬）、商品豬分析免疫效果，商品豬不論從免疫抗體陽性率還是抗體效價來看，都要高于種豬。后備種豬一般在8月齡進行首次配種，配種前1個月免疫1次（即三免），配種后則按照4個月免疫一次的程序進行免疫管理。而商品豬生長周期較短，一般在5個月左右，其免疫程序基本是按照30日齡、65日齡、95日齡、125日齡進行免疫，免疫間隔較短，免疫抗體保持在較高水平。種豬（后備種豬）、商品豬之間免疫程序的差異導致了兩者間免疫抗體的差異。

韋顯凱[2]等通過對豬口蹄疫免疫抗體的研究，得到結果是抗體陽性率一免、二免、三免依次升高，但沒有對四免及以后免疫情況進行研究，本文則將檢測的對象擴大到五免以后。從免疫次數看，一免至三免，免疫抗體陽性率均呈逐漸上升的趨勢，但四免后免疫抗體陽性率卻均呈下降走勢，到五免時則再次上升。這個現象目前尚無同樣報道或研究。通過對相關豬場進行調查，分析造成此現象的原因主要是：后備母豬首次配種時間一般在220～260日齡，而按照疫苗免疫程序，三免的時間在7～8月齡，配種時間恰好與三免時間重合，而豬場為了疫病防控的需要，會在配種前1個月對后備母豬實施免疫，免疫后再行配種。而四免時間在11～12月齡之間，此時的母豬妊娠期已達3～4個月，按照免疫程序應該實施免疫，但母豬即將臨產，為減少對母豬及胎兒的影響，免疫時間會被推后至分免疫后進行，這對免疫抗體的產生有一定影響。另一方面，生產后的母豬體內激素水平的變化也可能對免疫抗體的產生具有一定影響。 本項檢測中所采樣品為口蹄疫O型-亞洲I型二價滅活疫苗免疫程序免疫所得樣品，各場在實際生產中，免疫程序往往與疫苗推薦程序有差異，后備母豬基本能按照4個月免疫1次的推薦程序進行免疫，但商品豬則頻繁免疫，基本是按照1月1次開展免疫，整個生長周期中免疫4次。本項檢測中數據也表明，商品豬頻繁免疫，其免疫抗體水平雖比后備母豬略高，但差異并不顯著，因此其免疫程序并不合理。靳興軍等[3]曾對豬的口蹄疫亞洲I型疫苗探索免疫程序，研究確定了豬亞洲I型口蹄疫免疫程序：45日齡首免，間隔1.5～2個月二免，再間隔4～4.5個月三免， 以后每4～5個月免疫1次，以該程序進行免疫，免疫效果確實，該程序可以推薦作為商品豬免疫程序。

參考文獻

[1] 黃武光.豬的亞洲Ⅰ型口蹄疫的發病特點及控制措施研究[J].中國動物保健，2008（12）：92-94.

[2] 韋顯凱.規模豬場不同免疫次數對口蹄疫抗體產生效果的影響[J].南方農業學報，2014，45（3）：494-497.

[3] 靳興軍.豬亞洲I型口蹄疫免疫程序試驗[J].中國獸醫雜志，2006（9）：15-16.