新城疫病毒為疫苗載體的研究進展

董東曉 張東超 張文壯

摘要：文章綜述了新城疫病毒（NDV）的分子生物學特征、基因組結構，同時，重點介紹病毒載體的研究進展、反向遺傳學、新城疫病毒載體的應用研究進展等，為新城疫病毒載體的后續研究奠定了基礎。

關鍵詞：新城疫病毒；反向遺傳學；載體

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.00

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus， NDV）引起的一種禽類的急性、高度接觸性、烈性傳染病[1]。不僅對我國養禽業帶來巨大損失，在世界范圍的危害也極大。弱毒苗和滅活苗雖然能有效控制該病，但它們都還存在一定的缺陷，新城疫基因工程苗相對優越于傳統苗，所以，新城疫基因工程苗開始引起重視。隨著反向遺傳學的建立[2]，新城疫病毒載體疫苗的研發逐漸活躍起來，為構建新城疫和其他禽病的多聯苗奠定了基礎。

1 新城疫病毒分子的生物學特性

新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）為不分節段單股負鏈 RNA 病毒 （non segment negativesigle strain virus），本身不能作為 mRNA，不帶譯制病毒蛋白的信息，必須通過病毒自己的 RNA聚合酶轉錄出一股互補鏈作為 mRNA。新城疫病毒的負鏈 RNA，一方面轉錄成 mRNA，合成相應的病毒蛋白成分， 另一方面轉錄成其互補鏈 ，再合成病毒 RNA 鏈，參與病毒包裝。新城疫病毒粒子中心是一個與蛋白質相連接的單股負鏈 RNA所形成的螺旋形核衣殼，外包一雙層脂質囊膜，內襯有一層特殊的 M蛋白，囊膜外有大小2種糖蛋白纖突，前者具有血凝素和神經氨酸酶活性的 HN 蛋白組成，后者具有融合功能的 F蛋白組成。

1.1 新城疫病毒的形態特征

新城疫病毒又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或禽腦肺炎病毒，屬于副粘病毒科、副黏病毒亞科、腮腺病毒屬、禽副粘病毒I型（APMV-I）。成熟的新城疫病毒粒子的直徑為100～250 nm，由囊膜和核衣殼兩部分構成，囊膜是宿主細胞外膜脂類與病毒糖蛋白結合而形成的，表面有刺突，刺突長為8～12 nm，核衣殼是由病毒核酸和蛋白質衣殼粒結合后，對稱螺旋纏繞而成，直徑約為18 nm。新城疫病毒的核酸為單鏈負股、不分節RNA[3]（non segment negative single-stranded RNA，ssRNA）。

1.2 新城疫病毒的基因組結構

如圖1所示，新城疫病毒的基因結構包括NP、P、M、F、HN和L6個基因，基因組全長約為15kb；在基因組開放閱讀框（ORF）外側的3端有長為55nt的引導序列，5端有長為114nt或56nt的尾隨序列。6個基因分別編碼核衣殼結構蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素神經氨酸酶（HN）和大蛋白（L），leader序列和trailer序列在轉錄和復制中起到對基因組的調控作用。基因組所編碼的蛋白中HN、F、M蛋白為外部蛋白，F和HN蛋白位于囊膜的表面，M蛋白即與外膜蛋白相連，又與核衣殼相接。F蛋白在蛋白酶的作用下由前體F0裂解成F1和F2[4]，才能激發病毒的囊膜與宿主細胞膜融合，使病毒具有感染力；HN纖突蛋白中HA（血凝素）可識別唾液酸受體并與之結合，NA（神經氨酸酶）具有切除病毒表面的唾液酸將組裝好的病毒粒子與宿主分離的功能；蛋白對病毒囊膜的形成有重要作用，其功能在于參與病毒的組裝和調節病毒RNA的合成，使病毒具有感染性。NP蛋白、P蛋白、L蛋白為內部蛋白，與病毒RNA復合形成病毒的核衣殼；沒有內部蛋白參與，RNA不能進行轉錄和復制；病毒RNA的轉錄和復制需要內部蛋白的共同參與，形成具有活性的mRNA。

2 病毒載體的研究進展

近年來，隨著分子生物學的迅速發展，活載體疫苗已被廣泛研究和應用，它不僅克服了滅活苗的免疫性差和弱毒苗的毒力返強，而且具備了滅活苗安全性好和弱毒苗可產生局部免疫的優點，與此同時，活載體疫苗還具有構建多價苗和多聯苗的優點。在生物界中，病毒是最為簡單的微生物，因此，病毒載體為載體疫苗的研究和應用拓展了新思路。病毒分子生物學的研究逐漸成為熱門，尤其基因重組等技術的建立使各種病毒作載體成為可能，研究已發現有多種病毒可作為安全可靠的載體，如痘病毒載體、腺病毒載體、皰疹病毒載體、反轉錄病毒載體及副粘病毒載體等。

2.1 痘病毒載體

痘病毒為最大的DNA病毒，結構復雜，有核心、側體和包膜，呈磚形或橢圓形。痘病毒核酸為單線雙鏈DNA，基因組長130～300kb[5]。

痘病毒為載體在畜禽疫苗上研發和應用極其廣泛，從牛痘病毒可以預防人類天花，到痘疫苗代替牛痘病毒，再后來通過基因工程對豆苗病毒進行致弱，為痘病毒載體的構建奠定基礎。將牛瘟病毒基因組上的H基因重組到痘苗病毒基因組上進行表達，以及禽痘病毒基因組上重組新城疫、馬立克等病毒的基因片段表達。另外，修飾豆苗病毒安卡拉、豆苗病毒稿件痘苗、金絲雀痘病毒、粘液瘤病毒、豬痘病毒、山羊逗病毒等作載體也有相當多的研究。

2.2 腺病毒載體

腺病毒屬于腺病毒科，包括禽病毒屬和哺乳動物腺病毒屬。腺病毒核酸是由線狀雙股DNA組成，外無囊膜，而是20面體的蛋白衣殼；衣殼由240個六鄰粒和12個五鄰粒組成，六鄰粒構成20面體的20個面及棱，五鄰粒分別位于20面體的12個頂點。腺病毒的基因組長為36kb。

腺病毒腺病毒的基因組較大，具有能容納相當大片段的外源基因的潛力；而且對插入的外源基因高效表達的突出優點。目前對豬、綿羊、牛、犬、禽等腺病毒作載體研究相對成熟，也已取得很大的成果，如豬腺病毒為載體重組豬瘟病毒表達gp55蛋白等；禽腺病毒為載體分別重組雞傳染性法氏囊病毒表達VP2蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒表達纖突蛋白，等等。

2.3 皰疹病毒載體

皰疹病毒科有4個亞科：甲、乙、丙及未定名亞科。皰疹病毒是中小型雙股DNA病毒，皰疹病毒的基因組約為150kb。

皰疹病毒一般經黏膜途徑感染宿主，因此，皰疹病毒載體疫苗的可通過黏膜接種免疫。目前皰疹病毒或載體主要有牛皰疹病毒I型和Ⅳ型、犬皰疹病毒、火雞皰疹病毒、馬立克病病毒、傳染性喉氣管炎病毒、偽狂犬病病毒等。偽狂犬病毒載體疫苗應用相對比較成熟的載體，如將經典豬瘟病毒、口蹄疫病毒、傳染性胃腸炎病毒、圓環病毒-2、豬流感病毒、寄生蟲等基因片段重組到偽狂犬病毒基因組表達相應的抗原。

2.4 逆轉錄病毒載體

逆轉錄病毒是RNA病毒的一種，核心呈對稱的20面體，核心有核糖蛋白，外有囊膜包裹。核酸由雙股正鏈RNA構成。

一般逆轉錄病毒載體和包膜蛋白以及包裝細胞系共同組成反轉錄病毒表達系統，具有對重組基因高效表達的能力。逆轉錄病毒作載體可以感染各種細胞，而且感染率比較高，可達100%；而且轉入的外源基因可以完全整合。哺乳動物及鳥類中存在許多逆轉錄病毒，如鼠類的乳腺腫瘤病毒，莫洛氏小鼠白血病病毒，鳥類脾壞死病毒等，目前，對勞斯肉瘤病毒研究最為清晰。

2.5 副粘病毒載體

副粘病毒形狀多樣，直徑100 nm以上，病毒由囊膜和核衣殼構成，核衣殼由一條連續的負股RNA單鏈及蛋白結合，呈螺旋對稱。

隨著反向遺傳學的建立，反向遺傳學技術的發展，越來越多的RNA病毒載體成為可能，尤其是副粘病毒載體的研究比較活躍。目前副粘病毒科中新城疫病毒載體的研究已比較成熟，如以新城疫病毒為載體插入氯霉素乙酰轉移酶（CAT）基因、綠色熒光蛋白（GFP）基因、禽流感病毒HA基因、傳染性法氏囊病毒VP2基因等，都能將外源基因高水平的表達。

3 新城疫病毒為載體的研究進展

3.1 反向遺傳操作技術

反向遺傳學（reverse genetics）是相對于經典的遺傳學而言的。反向遺傳操作技術也叫感染性cDNA克隆技術，是將病毒RNA逆轉錄為cDNA，在病毒的cDNA水平上進行體外基因改造（如基因位點的突變、插入、缺失、轉換等），再將包裝好的病毒基因或直接轉染到細胞或易感宿主中，拯救出具有感染性RNA活的病毒或類似病毒的物質，根據拯救出的新病毒的表現特性研究RNA病毒基因組的結構、功能及研究應用等，通常又被稱為“病毒拯救（the rescue of virus）”，主要包括RNA干擾技術、基因沉默技術、基因體外轉錄技術等。反向遺傳學技術在新城病毒載體上的應用已相對成熟。

3.2 新城疫病毒作載體的優點

重組新城疫病毒作為活病毒載體的優點極多。新城疫病毒為負鏈RNA病毒，不能通過DNA復制，從RNA到RNA，并且整個復制過程在細胞漿中進行，病毒基因組將不會整合到宿主基因組中，所以，新城病毒作載體的安全性要高于DNA病毒作載體。NDV病毒作載體能很好的刺激病毒宿主產生體液免疫和細胞免疫以及局部黏膜免疫，對機體有較強的免疫保護；并可以長時間表達抗原基因，維持產生的高抗體滴度。由于新城疫存在普遍性，新城疫已為家禽防疫的重點病之一[6]，所以，重組新城疫病毒做活病毒載體有極大的經濟價值。新城疫弱毒苗生產成本低廉，而且新城疫疫苗的接種方式很多（滴鼻、點眼、噴霧、飲水、注射等），使用很方便。新城疫的遺傳特性相對穩定，只有一個血清型，毒株間的重組及毒力返強的可能性較小。NDV病毒對人沒有感染性，野生型新城疫病毒也僅會引起有輕微的病癥，因此，弱毒新城疫對人是安全的。由于新城疫病毒在的優點諸多，而且反向遺傳系統的建立，新城疫病毒作載體的研究越來受重視。

3.3 新城疫病毒為載體的應用研究進展

2000年，Krishnamurthy和Huang[7]等將氯霉素乙酰轉移酶（CAT）基因插入由中等毒力菌株Beaudette C重組的rNDV/BC基因組HN和L之間而獲得重組新城疫病毒rNDV/BC/CAT，并發現全長新城疫病毒cDNA的改變會影響rNDV的復制，但外源基因的插入使Beaudette C的毒力減弱[13]。后來，又以新城疫弱毒Lasota株為載體，在其基因組3端緊靠NP基因插入CAT基因，獲得重組新城疫病毒rLasota/CAT，并證明在新城疫病毒基因組的3端插入外源基因不影響其親本毒力。一系列的研究表明新城疫病毒可以作為一種新的活疫苗載體。

2003年，Engel-Herber[8]等以NDVClone-30株為載體，將綠色熒光蛋白（GFP）基因插入到載體基因組F基因和NH基因之間，重組獲得新城疫病毒rNDV/GFP1，并發現獲得的rNDV/GFP1和親本病毒株在雞胚中的復制能力及致病性基本一致，而且新的重組病毒能在雞胚中穩定的表達GFP。另外，在新城疫病毒感染細胞試驗中，感染病毒rNDV/GFP1株的細胞能檢測到GFP，而感染病毒Clone-30株的細胞不能表達GFP[14]。這對研究新城疫病毒病毒跟蹤奠定基礎，可以根據GPF的特性對病毒侵襲宿主的組織器官以及嚴重程度確定，同時，再次證明新城疫病毒是一種非常有前景的活疫苗載體。

2003年，Zhao[9]等將人的分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基因分別插入到新城疫病毒基因組的NP與P基因之間、M與F基因之間、HN與L基因之間以及L基因之后，獲得4株重組新城疫病毒株（rNDV/SEAP/NP-P、rNDV/SEAP/M-F、rNDV/SEAP/HN-L、rNDV/SEAP/L），以無毒株NDFL為親本對照進行研究試驗，發現重組新城疫病毒株產生的病毒滴度要低于親本毒株的抗體滴度，而且前，3株毒株對SEAP的表達量高于第4株重組新城疫毒株對SEAP的表達量[15]。感染雞胚成纖維細胞（CEF）產生的蝕斑結果也相似，另外，重組新城疫病毒的復制的起始時間相對親本毒株有所延遲，尤其是rNDV/SEAP/NP-P毒株。研究中的外源基因插入不同的位點，外源基因的表達量不同，而且對新城疫病毒產生的抗體滴度的影響也不同。因此，這對研究以新城疫病毒為載體，插入外源基因的合適位點有一定的指導意義；另外，也對新城疫病毒為載體插入多個外源基因構建多聯苗奠定基礎。

2004年，Huang等以新城疫病毒弱毒Lasota株為骨架，將雞傳染性法氏囊病毒變異株IBDV/GLS-5的VP2基因插入到Lasota基因組的3端，獲得重組新城疫病毒rLasota/VP2。該毒株對2日齡SPF雛雞免疫試驗結果顯示：rLasota/VP2可以對IBDV/GLS-5株和強度NDV/Texas株產生90%以上的保護力；若加強免疫，保護力可達到100%。試驗首次展示了構建新城疫病毒作其他病毒的疫苗的載體實例，證明了新城疫病毒作載體疫苗的可行性。

2006年，葛金英等將野生突變型H5亞型高致病性禽流感的HA基因插入到新城疫病毒Lasota株的P和M基因之間，獲得重組病毒rLasota-HAmut。另外，通過免疫學試驗證明，rLasota-HAmut作為載體疫苗具有良好的免疫原性及安全性[16]。Veits等將H5亞型的HA基因的開放閱讀框（ORF）插入到NDV Clone-30基因組的F和HN基因之間，再通過對ORF進行基因改造，獲得重組毒株NDVH5m。并通過試驗證明，NDVH5m可作為較為合適的載體疫苗選擇株。

2008年，葛金英等以NDV Lasota弱毒株為載體，將超強傳染性法氏囊（vvIBDV）的VP2基因插入到Lasota株基因組P基因和M基因之間，拯救出病毒rLasota-VP2株。通過重組病毒雞胚生長特性試驗，發現該毒株具有和親本Lasota毒株在雞胚中重高滴度和低致病力的特性；致病性試驗結果顯示，重組病毒有極高的穩定性；對7日齡雛雞免疫試驗結果發現，重組rLasota-VP2對新城疫強度F48E9株有100%的免疫保護力，對vvIBDV Gx株的保護力力在90%以上[17]。試驗為研制新城疫和傳染性法氏囊病二聯苗奠定基礎，此研究再次強有力的說明了新城疫病毒載體的可行性。

2009年，Nayak B等以NDV Lasota為載體，重組高致病性禽流感的HA基因，獲得rNDV-HA，并證明該重組株對H5N1亞型禽流感及強毒新城疫有較強的保護力。同年，胡順林等和陳化蘭等也做了類似的試驗，并獲得理想的結果[18]。

2010年，天津農學院焦利紅[12]以NDV弱毒苗rLasota和突變修飾的變異株rLasota-FmF為載體，將IBV Masasachusetts41株的S基因分別插入到rLasota的P和M基因之間，將S1基因分別插入到rLasota和rLasota-FmF的P和M基因之間，分別拯救出重組新城疫病毒rL-IBVS、rL-IBVS1和rL-FmF，這將為構建NDV載體的ND和IB二聯苗奠定基礎。

4 展望

近年來，新城疫病毒的生物學特性及基因結構等研究已較為清晰。伴隨反向遺傳學技術的更新，新城疫病毒作為載體研究已取得較為顯著地成就，為預防新城疫的同時預防其他禽病開辟了新思路。另外，新城疫病毒載體的研究相對其他RNA病毒載體的研究較為成熟，且新城疫病毒載體的安全性有著得天獨厚的優勢，由此可見，新城疫病毒載體的前景會越來越廣闊。

參考文獻

[1] Aldous E W，Alexander D J.Detection and differentiae of Newcastle disease virus （avian paramyxoviurs type 1）. Avain pahtol， 2001， 30（2）：117-128.

[2] Peeters B P，de Leeuw O S，Koch G，et al.Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA：Evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence[J].J Virol，1999，73（6）：5001-5009.

[3] 殷震.動物病毒學[M].第2版.北京： 科學技術出版社，1997.

[4] WertZ G W Perepeliti s V P Ball L A.Gene rearrangement and attenuated expression and let hality of anonsegmented negative strand RNA virus J.Proc Natl Acad $ci U $ A 1998（92）：8388-8392.

[5] Paoletti E.Poxvirus recombinant vaccines[J].Ann N Y Acad Sci， 1990，590（1）： 309-325.

[6] 戴建華，高崧. 新城疫病毒反向遺傳技術的研究進展[J].中國動物傳染病學報，2016（4）： 82-86.

[7] Krishnamurthy S， Huang Z， Samal S K.Recovery of a Virulent Strain of Newcastle Disease Virus from Cloned cDNA： Expression of a Foreign Gene Results in Growth Retardation and Attenuation[J].Virology， 2000， 278（1）：168-82.

[8] Engel HI，Weroer O，Teifke JP.Characterization of a recombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein.J Virol Methods，2003，108：19-28.

[9] Heng Zhao， B en P H.Peeters recombinant Newcastle disease virus as a viral vector： effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication [J].J General Virol， 2003（84）：781-788.

[10] Huang Z，Panda A Elankumaran S.The hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus determines tropism and virulence [J].Journal of Virology 2004，（78）：4176-4184.

[11] 葛金英.新城疫病毒反向遺傳操作基礎與應用研究[D].南京：南京農業大學，2006.

[12] 焦利紅.表達傳染性支氣管炎病毒S基因重組新城疫病毒疫苗的研究[D].天津：天津農學院，2010.

[13]段志強.新城疫病毒M蛋白功能結構域突變以及M蛋白與細胞核磷蛋白B23互作影響病毒復制的分子機制[D]. 揚州：揚州大學， 2014.

[14]劉佳旭.應用反向遺傳操作系統研究鵝源新城疫病毒NP基因5非編碼區六個核苷酸對病毒毒力的影響[D]. 長春：吉林大學，2015.

[15] 孟春春.ClassⅠ新城疫弱毒的毒力演化及自噬在新城疫病毒感染腫瘤細胞中的作用[D].北京：中國農業科學院，2012.

[16] 孫英杰.細胞自噬在新城疫病毒感染過程中的作用[D].北京： 中國農業科學院，2013.

[17] 張新濤.新城疫病毒NDV4-C株反向遺傳操作系統的建立及耐熱應用研究[D].北京：中國農業科學院，2013.

[18] 宋慶慶.新城疫病毒基因組生物信息分析及Mukteswar株毒力增強分子機制研究[D]. 揚州：揚州大學，2013.