植物原生質體PEG—高Ca2+—高pH融合法的研究

李琦

文章編號： 1005-2690（2018）07-0082-02 中圖分類號： Q943 文獻標志碼： B

摘 要：植物原生質體融合技術可打破物種生殖隔離障礙，實現基因在物種間的轉移和遺傳重組，創造出具有親本優良性狀的遠緣雜交物種。對于植物原生質體融合來說，PEG-高Ca2+-高pH融合法可使原生質體達到理想的融合效果，對植物培養有重要意義。主要介紹了PEG-高Ca2+-高pH融合法，為植物原生質體融合的研究發展提供基礎資料。

關鍵詞：原生質體；PEG-高Ca2+-高pH融合法；研究

在培養物中加入聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）可促使植物原生質體融合，而原生質體處于高pH高Ca2+的條件下也能促使原生質體融合。后來凱勒（Keller）發現了PEG-高Ca2+-高pH融合法。經試驗發現，PEG-高Ca2+-高pH融合法促進原生質體融合的效率較PEG融合法更加理想。

1 PEG-高Ca2+-高pH融合法的研究發現

1973年，Keller[1]在誘導煙草原生質體時發現，原生質體在高pH高Ca2+的條件下可發生融合。在多數試驗中發現，使用這一融合方法可使20%～50%的原生質體發生融合。1974年，Keller等發現，用含有高濃度Ca2+（7.35 g/L CaCl2·2H20）的強堿性溶液（pH值為9～10）清洗PEG時，原生質體融合的效果要比用培養基清洗高很多，因此將PEG融合法與高pH高Ca2+法結合在一起，建立了PEG-高Ca2+-高pH融合法。

該法的主要操作步驟是：用適當的比例將兩種不同的原生質體進行混合，使其形成小滴狀，在小滴狀的原生質體上及其周圍加上PEG溶液，使原生質體粘連融合；用高pH高Ca2+溶液清洗PEG，最后用培養基清洗，去高pH高Ca2+溶液。后來有學者對該法進行了改良[2]，將原生質體懸浮液滴入蓋玻片或離心管中，靜置使其形成薄層原生質體后，加入20%～40%的PEG 6 000、40%蔗糖、1.47 g/L CaCl2等融合液處理，經離心洗滌后培養，最后在固體平板培養基上培養。也有學者[3]或對鈣溶液進行替換，或對PEG進行改良，或對操作步驟進行改進，都獲得了融合原生質體。

2 PEG-高Ca2+-高pH融合法的作用機理

PEG是一種高分子化合物，含有醚鍵而具有負極性，可與蛋白質、水、碳水化合物等一些正極化基團形成氫鍵，PEG帶有大量的負電荷，也可與水之間形成氫鍵。因此，PEG與水、蛋白質、碳水化合物之間的氫鍵相結合，使溶液中自由水消失，植物細胞由于高度脫水使原生質體發生凝集，形成大小不一的凝集物，促進原生質體連接更加緊密。當PEG分子足夠長時，可作為鄰近原生質體表面之間的分子橋而使之粘連。同時由于PEG的負極性，能夠結合Ca2+與原生質體表面的負電荷形成靜電鍵，加強原生質體粘連和結合。

洗滌的過程中，連接在原生質體膜上的PEG分子可被洗脫下來，引起電荷的紊亂和再分布，也可能是被剝去蛋白質相鄰細胞膜類脂質間的反應，產生了變化與重排，導致細胞膜局部融合，形成小的細胞質橋，進而發生兩個原生質體的融合。高Ca2+與高pH環境的存在，加劇了電荷的不穩定性，促使重排的快速進行，增加了質膜的流動性，提高了融合效率。沖洗時產生的滲透和碰撞沖擊，也有可能促進融合的發生。但需要注意的是，PEG對細胞有一定的毒性作用，其相對分子質量越大，毒性越強。

3 影響PEG-高Ca2+-高pH融合法的因素

3.1 PEG的相對分子質量

一般所用的PEG相對分子質量為1 000～6 000，PEG分子量大于1 000時，才能誘導原生質體達到緊密的粘連和較為理想的融合效果，不同種類的原生質體對PEG分子量的要求不同。

3.2 PEG的濃度及處理時間

PEG的濃度較低或處理時間過短，會導致融合效果不理想；濃度過高或處理時間過長，會造成PEG對原生質體的毒害作用增強，可能造成原生質體的活性喪失，或減少異核體的融合率。

3.3 原生質體的生理狀況和密度

應選擇生理活性較高的原生質體進行融合，原生質體密度過高或過低都不利于原生質體的融合。密度低，融合效率較低；密度高，則會出現多重融合現象，導致雙核異質體含量減少，達不到預期的試驗和生產效果。一般原生質體的濃度要達到106～108個/mL。

3.4 原生質體的選擇及材料的預處理

沈前華等研究證明，雙子葉植物的葉片是原生質體的最佳材料，另外，愈傷組織、外植體和細胞懸浮物也常是原生質體的培養材料。有試驗表明，對植物材料預處理后的原生質體分離效率更高，且兩種原生質體的外觀最好選用易于區分的。

3.5 溫度

適當的高溫能提高融合效率，一般在20～30 ℃條

件下處理1～10 min。有試驗證明，在35～37 ℃條件下，特別有利于高度液泡化的原生質體融合。

3.6 PEG的清洗

應按一定的步驟進行，切勿劇烈清洗，易使異核體數目減少，原生質體遭到物理性破壞。

3.7 選擇配制合適的培養基

培養基內營養物的含量、pH值、滲透壓、激素的種類和比例等都根據不同植物原生質體的種類不同而有一定的差異。

參考文獻：

[ 1 ] Keller W A & Melchers G.Effect of high pH and calcium on

tobacco leaf protoplast fusion[J]. Z.Nalurforsch.C，1973（28）：

737-741.

[ 2 ] 鞏振輝，申書興.植物組織培養[M].北京：

化學工業出版社，2013.

[ 3 ] 黃國文.野燕麥原生質體制備和融合的

研究[J].安徽農業科學，2013，41（23）：

9 546-9 547.

（收稿日期：2018-06-08）