某院2011—2017年非痰標本產AmpC酶陰溝腸桿菌的臨床分布及耐藥性分析

謝朝云 熊蕓 覃家露 孫靜 楊懷 楊忠玲 熊永發

中圖分類號 R978.1；R969.3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）08-1069-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.14

摘 要 目的：為臨床合理用藥、醫院感染控制提供參考。方法：收集2011年1月-2017年10月某院非痰標本中分離出的產頭孢菌素酶（AmpC酶）陰溝腸桿菌，采用最低抑菌濃度法進行藥敏試驗，采用三維試驗法確證產AmpC酶情況，采用雙紙片協同擴散法檢測產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）情況。結果：該院非痰標本中共分離出產AmpC酶陰溝腸桿菌546株，占非痰標本病原菌總數的4.80%（546/11 375），占陰溝腸桿菌總數的38.97%（546/1 401）；檢出率排序前3位的非痰標本依次為傷口分泌物（27.29%）、中段尿（25.82%）、血液（21.79%），檢出率較高的科室依次為重癥監護病房（ICU）（22.89%）、神經外科（18.68%）和普外科（16.67%）。產AmpC酶陰溝腸桿菌對大部分常用抗菌藥物的耐藥率>40%，其中不同年度該菌對頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素、米諾環素的耐藥率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；但對亞胺培南、美羅培南的耐藥率<2%。546株產AmpC酶陰溝腸桿菌中，共檢出產ESBLs菌株68株，其2011-2017年的檢出率依次為5.77%、6.06%、8.70%、10.26%、13.79%、17.35%、18.75%。結論：該院產AmpC酶陰溝腸桿菌主要來自于傷口分泌物、中段尿等標本，且集中于ICU、神經外科等科室。該菌耐藥情況嚴峻，對β-內酰胺類、喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率上升明顯；產ESBLs菌株的檢出率逐年上升；但對碳青霉烯類抗菌藥物敏感，可將其作為經驗首選藥物。臨床應加強產AmpC酶陰溝腸桿菌耐藥及產酶情況的監測，并結合藥敏試驗結果合理選用抗菌藥物，以阻止或延緩其耐藥率的快速上升。

關鍵詞 非痰標本；陰溝腸桿菌；頭孢菌素酶；超廣譜β-內酰胺酶；臨床分布；耐藥性

ABSTRACT OBJECTIVE： To provide reference for rational drug use and hospital infection control. METHODS： AmpC enzyme-producing Enterobacter cloacae were isolated from non-sputum specimen of a hospital during Jan. 2011-Oct. 2017. Drug sensitivity test was conducted by using MIC. The situation of AmpC enzyme production was confirmed by three dimensional test， and that of ESBLs-producing stain was detected with double-disk synergy test. RESULTS： There were 546 strains of AmpC enzyme-producing E. cloacae isolated from non-sputum specimen of the hospital， accounting for 4.80% of non-sputum specimen （546/11 375） and 38.97% of E. cloacae （546/1 401）. Top 3 non-sputum samples in the list of detection rate were wound secretion （27.29%）， midstream urine （25.82%） and blood （21.79%）， and the departments with high detection rate were ICU （22.89%）， neurosurgery department （18.68%） and general surgery department （16.67%）. Resistance rate of AmpC enzyme-producing E. cloacae to most commonly used antibiotics was higher than 40%. There was statistical significance in resistant rate of the bacteria to ceftriaxone， cefotaxime， gentamicin， nitrofurantoin， levofloxacin， piperacillin/tazobactam， cefoperazone， ceftazidime， cefepime， tobramycin and minocycline among different years （P<0.05）. The resistant rate to imipenem and meropenem was lower than 2%. Among 546 strains of AmpC enzyme- producing E. cloacae， 68 strains of ESBLs were detected， and detection rates were 5.77%， 6.06%， 8.70%， 10.26%， 13.79%， 17.35%， 18.75% during 2011-2017. CONCLUSIONS： AmpC enzyme-producing E. cloacae are mainly isolated from samples as wound secretion and midstream urine， and mainly come from ICU and neurosurgery department. The drug resistance of the bacteria is severe， and drug resistance of the bacteria to antibiotics as β-lactams and quinolones is increased significantly. The detection rate of ESBLs-producing strain increases year by year. The bacteria are sensitive to carbapenems antibiotics， which can be regarded as first choice. It is necessary to strengthen drug resistance and enzyme production monitoring of AmpC enzyme-producing E. cloacae， select antibiotics combined with results of drug sensitivity test so as to prevent or delay the rapid increase of its resistance rate.

KEYWORDS Non-sputum specimen； Enterobacter cloacae； AmpC enzyme； ESBLs； Clinical distribution； Drug resistance

頭孢菌素酶即AmpC酶（AmpC enzyme）是介導陰溝腸桿菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的最重要的酶，主要由染色質或質粒介導編碼產生[1]。由于抗菌藥物的不合理使用，產AmpC酶陰溝腸桿菌越來越多，已成為臨床治療的難題[1]。統計分析產AmpC酶陰溝腸桿菌的臨床分布與耐藥趨勢，可為臨床合理選用抗菌藥物提供參考；但既往研究大多未剔除痰標本或以痰標本為主，易受到環境污染與定植菌的干擾，使結果備受質疑[2]。因此，本研究對貴州醫科大學第三附屬醫院2011年1月-2017年10月臨床非痰標本（傷口分泌物、清潔中段尿、血液、胸腔積液、腹水、穿刺液、腦脊液等）分離出的產AmpC酶陰溝腸桿菌的臨床分布進行分析，對菌株耐藥性及其變化情況進行探討，以期為臨床合理用藥、醫院感染控制提供參考。

1 材料

PhoenixTM 100型全自動細菌鑒定藥敏系統及配套試劑（美國BD公司）；NS-100B型臺式空氣浴恒溫搖床（上海皓莊儀器有限公司）；Avanti J-E型多用途高效離心機[貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司]；頭孢西丁、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢他啶等藥敏紙片以及M-H平板、肉湯培養基均購自英國Oxoid公司；質控菌株產酶型大腸埃希菌（ATCC 35218）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、大腸埃希菌（ATCC 25922）由原衛生部臨床檢驗中心提供。

2 資料與方法

2.1 菌株來源

來源于該院2011年1月-2017年10月臨床送檢的非痰標本中分離出的產AmpC酶陰溝腸桿菌，剔除同一患者檢出的重復菌株。

2.2 菌株分離、培養、鑒定及藥敏試驗

所有菌株均按照《全國臨床檢驗操作規程》（第3版）[3]進行分離、培養，采用PhoenixTM 100型全自動細菌鑒定藥敏系統進行鑒定，采用上述儀器和最低抑菌濃度法（Minimum inhibitory concentration，MIC）進行藥敏試驗，結果判定參照美國臨床和實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）各年的標準。

2.3 產AmpC酶菌株的確證

產AmpC酶菌株的確證采用三維試驗法[4]。取待測菌株菌落1～2個，接種于肉湯培養基中，置于35 ℃、200 r/min恒溫搖床中培養6 h后，以離心半徑16 cm、轉速4 000 r/min離心30 min，取沉淀凍融（-20 ℃～室溫）5次，加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）混勻，于4 ℃下以離心半徑16 cm、轉速12 000 r/min離心60 min，上清液即為待測菌株β-內酰胺酶粗提液，將上述粗提液置于-20 ℃冰箱中保存，備用。另將0.5麥氏濁度單位的質控菌株[大腸埃希菌（ATCC 25922）]菌懸液均勻涂布在M-H平板中，將一張頭孢西丁藥敏紙片貼于平板中央，于紙片邊緣5 mm處鉆一小孔，加入待測菌株β-內酰胺酶粗提液50 μL，于35 ℃下培養16～18 h。若小孔與抑菌圈交接處長菌區域擴大，則判定待測菌株產AmpC酶。

2.4 產超廣譜β-內酰胺酶（Extended spectrum beta- lactamase，ESBLs）菌株的檢測

產ESBLs菌株的檢測采用雙紙片協同擴散法，結果判定參照CLSI推薦標準[5]。將待測菌株接種于M-H平板上，分別將頭孢他啶（30 μg）、頭孢他啶/克拉維酸（30 μg/10 μg）、頭孢噻肟（30 μg）、頭孢噻肟/克拉維酸（30 μg/10 μg）藥敏紙片貼于平板上，于35 ℃下培養16～18 h。若頭孢噻肟抑菌圈直徑≤27 mm，頭孢他啶抑菌圈直徑≤22 mm，則初篩為ESBLs陽性；若頭孢他啶/克拉維酸或頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈直徑比頭孢他啶或頭孢噻肟的抑菌圈直徑增大≥5 mm，則判定待測菌株產ESBLs。

2.5 數據處理

應用WHONET 5.6軟件對藥敏試驗結果進行處理，采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以株數或率表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 產AmpC酶陰溝腸桿菌分布情況

該院非痰標本中共分離出病原菌11 375株，包括腸桿菌科細菌4 588株、陰溝腸桿菌1 401株，其中產AmpC酶陰溝腸桿菌546株（2011-2017年依次為52、66、69、78、87、98、96株），占非痰標本病原菌總數的4.80%，占腸桿菌科細菌總數的11.90%，占陰溝腸桿菌總數的38.97%。546株產AmpC酶陰溝腸桿菌主要來自于傷口分泌物、中段尿與血液標本，分別占27.29%、25.82%、21.79%，詳見表1。

3.2 產AmpC酶陰溝腸桿菌的科室分布

該院非痰標本中分離出的546株產AmpC酶陰溝腸桿菌主要來自于重癥監護病房（Intensive care unit，ICU）、神經外科和普外科，分別占22.89%、18.68%、16.67%，詳見表2。

3.3 產AmpC酶陰溝腸桿菌的耐藥情況

該院非痰標本分離出的產AmpC酶陰溝腸桿菌對常用抗菌藥物的藥敏試驗結果顯示，該菌對大部分常用抗菌藥物的耐藥率較高（耐藥率>40%），且總體呈上升趨勢；其中，不同年度該菌對頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素、米諾環素的耐藥率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；該菌對亞胺培南、美羅培南敏感（耐藥率<2%），詳見表3。

3.4 產ESBLs菌株的檢出情況

546株產AmpC酶陰溝腸桿菌中，共檢出產ESBLs菌株68株，2011-2017年依次檢出3、4、6、8、12、17、18株，檢出率依次為5.77%、6.06%、8.70%、10.26%、13.79%、17.35%、18.75%，呈逐年上升的趨勢。

4 討論

痰是下呼吸道分泌物，由于解剖部位特殊，咳出痰液經過咽部和口腔時，會不可避免地混入上呼吸道中的正常或定植菌群，直接影響病原學檢查結果，導致其結果備受質疑[2]。鑒于此，本研究以該院臨床送檢的非痰標本作為研究對象，對其檢出的產AmpC酶陰溝腸桿菌的臨床分布和耐藥情況進行分析，以期更為真實地反映產AmpC酶陰溝腸桿菌的病原學特征。

本研究結果顯示，該院非痰標本檢出的產AmpC酶陰溝腸桿菌占陰溝腸桿菌總數的38.97%，低于楊洪芬等[6]報道的47.1%，可能與不同地區陰溝腸桿菌的耐藥情況有所差異有關[7]。該院產AmpC酶陰溝腸桿菌的檢出率在傷口分泌物、中段尿和血液等標本中較高，分別為27.29%、25.82%和21.79%，與莫基浩等[8]的報道結果接近，提示該院產AmpC酶陰溝腸桿菌所致呼吸道外感染以傷口、泌尿道與血流感染較為常見。

該院非痰標本中檢出的產AmpC酶陰溝腸桿菌多來自于ICU（22.89%）、神經外科（18.68%）和普外科（16.67%）。上述科室收治的患者免疫功能低下、基礎疾病多、病情復雜，且大多病情重、住院時間長，需接受手術、機械通氣、動靜脈插管等創傷性診療，同時伴意識障礙及長期使用廣譜抗菌藥物等情況，易導致產酶陰溝腸桿菌的定植與感染，臨床應予以密切關注[9]。

藥敏試驗結果顯示，非痰標本中檢出的產AmpC酶陰溝腸桿菌對頭孢曲松、哌拉西林、頭孢哌酮的耐藥率已超過50%，對大部分常用抗菌藥物的耐藥率已超過40%，提示該院產AmpC酶陰溝腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥情況嚴峻，不建議臨床將其作為治療該菌感染的首選藥物。該菌對常用抗菌藥物的耐藥主要與菌株產生AmpC酶有關[10]。AmpC酶不僅可由染色質介導，也可由質粒介導編碼產生，還可通過接合子、整合子移位，質粒復制及轉化等方式在同種屬或不同種屬革蘭氏陰性菌間傳播，引起暴發流行，是介導陰溝腸桿菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因[1，11]。本研究顯示，該酶可與抗菌藥物β-內酰胺環羰基部分共價結合，使β-內酰胺環開環，導致菌株對頭孢菌素類等抗菌藥物高水平耐藥，且不被克拉維酸等β-內酰胺酶抑制劑所抑制[12]。同時，產AmpC酶陰溝腸桿菌易產生ESBLs[13]，ESBLs同樣可水解β-內酰胺類抗菌藥物的β-內酰胺環，使菌株對β-內酰胺類尤其是第三代頭孢菌素類抗菌藥物耐藥[14]；此外，產酶基因可通過垂直傳播、質粒或轉座子等傳播方式傳遞給非產ESBLs菌株，導致其對青霉素類、第一～三代頭孢菌素類和單環β-內酰胺類抗菌藥物耐藥[15]。本研究顯示，該菌僅對亞胺培南和美羅培南的耐藥率較低（耐藥率<2%），與Doi Y等[16]的報道相近，提示碳青霉烯類抗菌藥物可作為臨床治療產AmpC酶陰溝腸桿菌感染的經驗首選藥物。

本研究結果顯示，該院546株產AmpC酶陰溝腸桿菌中，產ESBLs菌株的檢出率從2011年的5.77%上升至2017年的18.75%，呈逐年上升的趨勢；同時，近7年來該菌對常用抗菌藥物的耐藥率總體呈上升趨勢，且其各年對頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素、米諾環素的耐藥率比較，差異均有統計學意義。這提示該菌的耐藥率變化明顯，且主要表現為對β-內酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、第四代頭孢菌素類抗菌藥物的耐藥率上升明顯，筆者認為可能與產AmpC酶陰溝腸桿菌常同時攜帶氨基糖苷類修飾酶基因、喹諾酮類耐藥基因和磺胺類耐藥基因，產生氨基糖苷類鈍化酶，主動外排系統的活躍，細菌DNA旋轉酶的變異，細胞壁屏障的改變，耐藥基因的水平轉移和克隆傳播等因素有關[17-18]。值得注意的是，該院產AmpC酶陰溝腸桿菌對第四代頭孢菌素類藥物頭孢吡肟的耐藥率明顯升高（由21.15%上升至40.63%），與余建洪等[19]的研究結果不同，可能與臨床不合理使用抗菌藥物尤其是第四代頭孢菌素類抗菌藥物有關[20]。耐藥率的明顯升高是一個危險信號，臨床應予以高度重視，加強消毒隔離，嚴格執行抗菌藥物分級管理制度，提高臨床標本送檢率，在細菌培養、鑒定及藥敏試驗指導下合理選用抗菌藥物，保證臨床抗感染治療的安全、有效[20]。

綜上所述，該院產AmpC酶陰溝腸桿菌主要來自于傷口分泌物、中段尿和血液等非痰標本，主要集中于ICU、神經外科和普外科，易引起傷口、泌尿道、血液等呼吸道外感染。該菌耐藥情況嚴峻，對β-內酰胺類、喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率上升明顯；產ESBLs菌株的檢出率逐年上升；但對碳青霉烯類抗菌藥物較為敏感，可將其作為經驗首選藥物。臨床應注意加強產AmpC酶陰溝腸桿菌耐藥及產酶情況的監測，及時掌握其耐藥率的變化趨勢，結合藥敏試驗結果合理選用抗菌藥物，以阻止或延緩其耐藥率的快速上升。本研究雖初步反映了產AmpC酶的臨床分布及耐藥性變化情況，但其耐藥機制、耐藥基因、產酶量等方面仍有待后續深入研究。

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（收稿日期：2017-11-03 修回日期：2017-12-30）

（編輯：張元媛）