EMIT法檢測環(huán)孢素血藥濃度的動態(tài)飄逸校正系數研究

周清武

中圖分類號 R917；R979.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）08-1078-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.16

摘 要 目的：探討酶放大免疫測定技術（EMIT）檢測環(huán)孢素血藥濃度的動態(tài)飄逸校正系數。方法：針對EMIT法檢測環(huán)孢素藥物濃度的動態(tài)飄逸現象，以質量濃度為100 ng/mL的環(huán)孢素定標液為待測樣品，選擇其第58、101次檢測結果來進行動態(tài)飄逸相關系數的推擬；分別以上述系數對第1、20、45、77、106、115次檢測結果進行校正，考察校正質量濃度與真實質量濃度的差異。結果：推擬得動態(tài)飄逸系數k=（1+0.001 235×n0.419 5）n，動態(tài)飄逸校正系數k′ =1/[（1+0.001 235×n0.419 5）n]。各次檢測結果經校正后，其校正質量濃度與真實質量濃度的相對誤差在±4%之內。結論：推擬所得的動態(tài)飄逸校正系數可用于環(huán)孢素質控樣品濃度的動態(tài)校正，有助于環(huán)孢素血藥濃度的準確檢測。

關鍵詞 酶放大免疫測定技術；環(huán)孢素；血藥濃度；動態(tài)飄逸；校正系數

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the dynamic upwarp state correction coefficient of cyclosporine blood concentration determined by EMIT. METHODS： The dynamic upwarp state of cyclosporine concentration was determined by EMIT. The cyclosporine calibration reagents with concentration of 100 ng/mL was used as the sample to be measured， the 58th and 101st test results were selected to simulate the dynamic upwarp state related coefficients， and the 1st， 20th， 45th， 77th， 106th， 115th test results were corrected by above coefficients. The difference of correction quality concentration with real quality concentration was investigated. RESULTS： The dynamic upwarp state coefficient [k=（1+0.001 235×n0.419 5）n] and dynamic upwarp state correction coefficient {k′ =1/[（1+0.001 235×n0.419 5）n} were obtained. After determination results were corrected， relative error of corrected quality concentration with real quality concentration was within ±4%. CONCLUSIONS： The obtained dynamic upwarp state correction coefficient can be used for dynamic calibration of cyclosporine quality control concentration， which contribute to correct determination of blood concentration of cyclosporine.

KEYWORDS EMIT； Cyclosporine； Blood concentretion； Dynamic upwarp state； Correction coefficient

環(huán)孢素是臨床常用的免疫抑制劑之一，主用于肝、腎、骨髓等器官/組織移植以及再生障礙性貧血、腎病綜合征、干燥綜合征等異常免疫性疾病的治療[1-6]。由于環(huán)孢素的生物利用度及肝消除等個體差異大、治療窗窄，容易導致治療無效或中毒[7-8]，故需通過治療藥物監(jiān)測（Therapeutic drug monitoring，TDM）來指導其臨床個體化合理用藥。

酶放大免疫測定技術（Enzyme multiplied immunoassay technique， EMIT）是目前臨床TDM的主要手段之一，具有自動化程度高，可多品種、多樣本連續(xù)檢測，檢測時間短，樣品處理簡單，規(guī)律性強等特點，且當試劑瓶中的試劑較多時，相鄰質控樣品檢測的重現性較好[9]。但該法所用試劑昂貴，且當試劑瓶中的試劑較少時，檢測結果會出現偏差，重現性較差[10-12]。上述偏差的規(guī)律性很強，呈現動態(tài)飄逸現象（即EMIT法檢測環(huán)孢素全血樣品時，隨著檢測次數的增加、試劑瓶中試劑的揮發(fā)，其質控樣品的實測質量濃度會持續(xù)向上飄逸，且試劑越少，飄逸值越大，特別是在批量檢測次數較少的試驗中尤為突出）[12]。過去常用多次定標或質控來糾正偏差，但必然會造成大量的試劑浪費，增加檢測成本。因此，為獲取準確的環(huán)孢素血藥濃度檢測數據，本研究探討了EMIT法檢測人全血環(huán)孢素藥物濃度的動態(tài)飄逸相關系數，以動態(tài)校正環(huán)孢素實測質量濃度，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

Viva-E型全自動生化儀（德國Siemens公司）；Vortex-5型漩渦混合器（上海精宏實驗設備有限公司）；Sorvall Legend Micro 21型高速臺式離心機（德國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

環(huán)孢素檢測試劑盒（包括環(huán)孢素抗體試劑A和酶試劑B，批號：6R079UL-J2、6R119UL-J2）、環(huán)孢素樣本預處理液（含硫酸銅、甲醇和乙二醇等蛋白沉淀劑，批號：6R719UL-J2）、環(huán)孢素定標液（質量濃度分別為0、50、100、200、350、500 ng/mL，批號：6R119UL-H2）；雷帕霉素/他克莫司/環(huán)孢素三合一質控樣品（雷帕霉素與他克莫司的質量濃度均為4.5、11、22 ng/mL，環(huán)孢素質量濃度為80、200、350 ng/mL，批號：6019）均購自美國Siemens Healthcare Diagnostics公司。

1.3 全血樣品來源

全血樣品來自于我院行環(huán)孢素TDM的門診及住院患者。

2 方法與結果

2.1 全血樣品的處理

將環(huán)孢素全血樣品上下顛倒10～15次，輕搖混勻，靜置10 s，備用。依次精密吸取環(huán)孢素樣本預處理液300 μL和環(huán)孢素全血樣品100 μL，置于1.5 mL聚氯乙烯（PVC）離心管中，渦旋15 s后，靜置2 min，以離心半徑5 cm、轉速14 000 r/min離心2 min。精密吸取上清液約250 μL，置于2 mL PVC試管中，上機檢測。

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線的繪制 取出貯存于2～8 ℃冰箱中的環(huán)孢素檢測試劑盒，置于26 ℃水浴中靜置5 min，平衡至室溫，按“2.1”項下方法處理環(huán)孢素定標液，使用全自動生化儀檢測，按儀器操作規(guī)范進行定標。以吸光度（A）為縱坐標、待測物血藥濃度（c）為橫坐標，得環(huán)孢素回歸方程為A=0.271 692+0.080 597{1/[1+e（7.636 17-1.473 60lnc）]}。結果顯示，環(huán)孢素血藥濃度檢測線性范圍為40～500 ng/mL。

2.2.2 精密度和準確度試驗 分別取低、中、高質量濃度（80、200、350 ng/mL）的環(huán)孢素質控樣品各適量，按“2.1”項下方法處理后，進樣分析。單日內平行操作5次，連續(xù)測定5 d，考察精密度和準確度。結果顯示，各質控樣品的日內、日間RSD均小于9%，相對誤差均低于3%，符合《中國藥典》對生物樣品定量分析的要求[13]，詳見表1。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取低、高質量濃度（80、350 ng/mL）的環(huán)孢素質控樣品各適量，在室溫條件下分別放置8、24 h后，按“2.1”項下方法處理，進樣分析，考察其穩(wěn)定性（各質量濃度平行操作5次）。結果顯示，各質控樣品在室溫條件下放置8、24 h穩(wěn)定，相對誤差在±3%以內（RSD<7%，n=5），詳見表2。

2.3 動態(tài)飄逸現象的發(fā)現

筆者在采用EMIT法檢測環(huán)孢素血藥濃度的過程中發(fā)現，隨著檢測次數（n）的增加，試劑瓶中的試劑逐漸減少，質控樣品的實測質量濃度會逐漸升高，且初始升高的幅度較小，隨后幅度逐漸增大，呈現動態(tài)飄逸現象，具有非常穩(wěn)定的規(guī)律性，即“試劑瓶底效應”[12，14]。故擬用恰當的數學函數式來表示，以有助于獲取更為準確的檢測結果。

2.4 動態(tài)飄逸相關系數的推擬

2.4.1 相關假設及公式推導 設定動態(tài)飄逸系數為k，得：

該式中，c測定為實測質量濃度，c真實為真實質量濃度（即標示質量濃度）。

設定每次實測質量濃度與上次實測質量濃度比較（首次檢測即為其實測結果與真實質量濃度比較）增加的平均系數為a，那么第1次檢測的動態(tài)飄逸系數為（1+a），第2次檢測的動態(tài)飄逸系數為（1+a）2，第3次檢測的飄逸系數為（1+a）3，第n次檢測的動態(tài)飄逸系數為：

研究過程中發(fā)現，a值也同樣存在動態(tài)飄逸現象，且呈現出先小后大的上翹拋物線，可用指數函數來表示。設定指數函數的變量為n（即檢測次數），系數為b，指數為c，得a的指數函數為：

2.4.2 a、b、c值的計算 當n值較小時，實測質量濃度的飄逸值也較小，故本研究以真實質量濃度為100 ng/mL的環(huán)孢素定標液為待測樣品（環(huán)孢素有效治療濃度為100～200 ng/mL[7]），選擇其第58次和第101次的檢測結果（前期試驗顯示，當n為50、100左右時，其k值突躍明顯且適中）來計算a、b、c值。其中，第58、101次的實測質量濃度分別為c58=148.0 ng/mL，c101=236.5 ng/mL。由式③解得：a58=e[ln（148.0/100）/58]-1=0.006 78，a101=e[ln（236.5/100）/101]-1=0.008 56；由a58、a101、式④解得：b=0.001 235，c=0.419 5。

2.4.3 k的推擬 將b、c值代入式⑥，即得環(huán)孢素血藥濃度檢測的動態(tài)飄逸系數k=（1+0.001 235×n0.419 5）n。檢測次數（n）與動態(tài)飄逸系數（k）的關系圖見圖1。

2.4.4 k′ 的推擬 由式⑦可知，環(huán)孢素標準質控檢測的動態(tài)飄逸校正系數k′ =1/[（1+0.001 235×n0.419 5）n]。

2.5 驗證試驗

以真實質量濃度為100 ng/mL的環(huán)孢素定標液作為待測樣品，以k′ 對其第1、20、45、77、106、115次檢測結果進行校正。結果顯示，各校正質量濃度與真實理論濃度的相對誤差在±4%之內，詳見表3。

2.6 不同批次環(huán)孢素檢測試劑盒k與k′ 值的比較

以近期使用的2個不同批次的環(huán)孢素檢測試劑盒為研究對象，采用上述方法測定其k和k′ 。當n=120時，得2個批次環(huán)孢素檢測試劑盒的k分別為3.002（k1）和3.223（k2），k′ 分別為0.333（k′ 1）、0.310（k′ 2）；采用上述2種檢測試劑盒檢測環(huán)孢素全血樣品得實測質量濃度為300.2 ng/mL（n=120），分別經k′ 1、k′ 2校正得校正質量濃度分別為100.0、93.1 ng/mL，兩者的相對誤差為-6.90%，提示其差異較小。

3 討論

3.1 EMIT法標準操作規(guī)程及注意事項

EMIT法為臨床環(huán)孢素TDM的常用方法之一。全血樣品中的環(huán)孢素與酶試劑中標記的重組酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（rG6PDH）的環(huán)孢素發(fā)生競爭結合，有活性的rG6PDH將抗體試劑中的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉化為還原型，從而導致酶活性下降，引起吸光度的改變。EMIT法具有專屬性強、自動化程度高、可連續(xù)檢測、檢測時間短、樣品處理簡單等特點，其必要的標準操作規(guī)程及注意事項如下[9]：

3.1.1 儀器系統(tǒng) 定期清洗比色盤及進樣針，可以減少比色盤的污染程度，減緩比色盤空白值的上升速度，棄用空白值偏差較大的比色杯；應確保系統(tǒng)液體管路不漏氣，系統(tǒng)用純化水電導率<10 μS/cm；將新制純化水裝滿系統(tǒng)用水專用塑料桶后，立即加蓋密封，并靜置24 h以上以排盡桶內空氣，從而降低微生物污染和生長的概率。

3.1.2 環(huán)境溫度、濕度 EMIT法檢測溫度要求在18～25 ℃內，室溫變化對檢測結果會有較大影響[11，15]。因此，為減少溫度變化對檢測的影響，本研究將室溫控制在21～23 ℃內波動，溫差<2 ℃，以減少溫度對檢測的不良影響[11-12]；將相對濕度保持在50%左右，以減少試劑揮發(fā)量的波動。

3.1.3 環(huán)孢素標準樣品的分裝 將環(huán)孢素定標液和質控品置于-20℃冰箱中貯存；使用前應將其置于26 ℃水浴中靜置10 min，平衡至室溫，顛倒輕搖10～15次使之混勻，靜置10 s后，精密吸取100 μL至1.5 mL PVC管中，密封貯存于-20 ℃的冰箱中，并在有效期內使用，以確保環(huán)孢素定標液和質控樣品質量濃度的穩(wěn)定。

3.1.4 環(huán)孢素檢測試劑盒 將環(huán)孢素檢測試劑盒放置于2～8 ℃冰箱中貯存；使用前將其置于26 ℃水浴中靜置5 min，平衡至室溫；檢測結束時，立即封蓋并放回冰箱中，盡量縮短室溫放置時間，以有助于保持試劑穩(wěn)定。

3.2 動態(tài)飄逸現象的原因分析

（1）單個樣品檢測需用時14 min；當進行多個樣品批量檢測時，每增加1個樣品，耗時需增加0.5 min。試劑瓶口內徑為1.4 cm，且瓶底伴有冷風（溫度：16.5 ℃）。隨著檢測時間的延長，試劑瓶中的溶劑揮發(fā)導致試劑濃縮，是引起EMIT法動態(tài)飄逸現象的根本原因。（2）由于臨床檢測需要，會對檢測試劑進行分裝，因此多次出現“試劑瓶底效應”，從而影響檢測結果，加速試劑揮發(fā)，造成動態(tài)飄逸現象。（3）檢測儀器同樣也會對檢測結果造成影響，現有儀器尚無法解決檢測過程中廣口試劑瓶溶劑揮發(fā)的問題，仍有待于生產廠商的進一步研發(fā)。

3.3 檢測時長與批量檢測

由前期試驗可知，試劑揮發(fā)量與檢測時長有關。對于相同數量的待測樣品，批量檢測越多，所需檢測時長越短，試劑揮發(fā)量越少，動態(tài)飄逸系數則越小。本研究所用儀器的樣品盤中共51個樣本位，若使用環(huán)孢素檢測試劑盒測定120個全血樣本（額定檢測量），單獨檢測所需的最大時長為1 680 min；而批量檢測所需的最小時長僅為101 min，相當于單獨檢測8次（n=8），由“2.4.3”項下公式計算可知，動態(tài)飄逸系數k8=1.024，比k0（k0=1）增加了2.4%，檢測偏差<3%。因此，筆者建議盡可能批量檢測，以有效縮短檢測時間及動態(tài)飄逸系數；此外，為減少試劑揮發(fā)，檢測完畢后應盡快密封試劑瓶。

3.4 k與k′ 值的實際應用價值

（1）使用k值，可預知環(huán)孢素實測質量濃度的動態(tài)飄逸倍數，由k=（1+0.001 235×n0.419 5）n可知，當n=29時，動態(tài)飄逸系數k29=1.158，k29比k0增加了15.8%，檢測偏差會超過2015年版《中國藥典》（四部）對生物樣品定量分析準確度的要求（15%之內）[13]，應引起TDM工作者的注意。此外，由于EMIT法測定環(huán)孢素血藥濃度的定量上限為500 ng/mL，而當n=87時，k87=2.007，其實測質量濃度會增加1倍，故第87次以后的檢測，預估環(huán)孢素質量濃度>250 ng/mL的全血樣品應先用空白全血稀釋1倍后再行檢測；該法的定量下限為40 ng/mL，當k>3時，檢測全血樣品的真實質量濃度可低至14 ng/mL。（2）使用k′ 值，可將環(huán)孢素實測質量濃度換算為真實質量濃度，有助于獲取更為準確的檢測結果。

3.5 EMIT法檢測環(huán)孢素藥物濃度的校正方法比較

（1）定標法：當實測質量濃度與真實質量濃度存在較大偏差時，首先考慮的是重新定標，優(yōu)點是重新獲得定標曲線，且短期內準確度較高；但會造成昂貴試劑的大量浪費，且使用不久后便會再次出現較大偏差，不得不重新定標，對于批量檢測較少的實驗室而言，勢必會增加檢測成本。（2）質控法：即每做10次樣品檢測，便進行1次質控檢測，用所得的校正系數來校正環(huán)孢素全血樣品的實測質量濃度；或者在批量檢測的樣品盤中放置1個標準質控樣品，行同法校正，以解決同批次樣品檢測的準確性問題[12]。該法的優(yōu)點是短期內準確度好，但不適用于以單個樣品檢測為主的實驗室。（3）動態(tài)飄逸校正法：采用本研究所推擬的動態(tài)飄逸校正系數，只需不定期進行標準質控驗證檢測，即可清楚了解儀器系統(tǒng)檢測的準確程度，且經校正后的實測質量濃度準確度較高，有效地減少了試劑的浪費。上述3種校正方法均有助于獲取更為真實的實測數據，但與前兩者比較，動態(tài)飄逸校正法在減少試劑浪費、提高檢測效率等方面更具有優(yōu)勢。

4 結語

綜上所述，EMIT法檢測環(huán)孢素藥物濃度存在動態(tài)飄逸現象，可采用本研究推擬所得的動態(tài)飄逸校正系數對檢測結果進行動態(tài)校正，有助于環(huán)孢素血藥濃度的準確檢測，可為臨床TDM工作的順利開展提供技術支持。

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（收稿日期：2017-05-13 修回日期：2018-02-28）

（編輯：張元媛）