聲光可調(diào)—近紅外光譜法快速測定丹參藥材中隱丹參酮的含量

蘇婷 姜文月 邢成 任緒華 李心冬 崔憲利 高陸

中圖分類號(hào) O631.6；R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）08-1044-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.08

摘 要 目的：建立快速測定丹參藥材中隱丹參酮含量的方法。方法：采用高效液相色譜法測定藥材樣品中隱丹參酮含量（作為參考值）。采用聲光可調(diào)-近紅外光譜法結(jié)合偏最小二乘法建立藥材樣品中隱丹參酮含量的定量模型：根據(jù)藥材樣品中隱丹參酮含量測定結(jié)果，采集35份藥材樣品，以一階導(dǎo)數(shù)法聯(lián)合平滑濾波系數(shù)法預(yù)處理光譜，藥材樣品中隱丹參酮含量測定最佳波段范圍為1 250～2 150 nm。結(jié)果：藥材樣品中隱丹參酮含量測定方法學(xué)經(jīng)驗(yàn)證符合要求。隱丹參酮定量模型的校正均方根偏差為0.014 6，預(yù)測均方根偏差為0.022 3，相關(guān)系數(shù)為0.976 6。內(nèi)部驗(yàn)證偏差為2.41%，外部驗(yàn)證偏差為4.06%。結(jié)論：該方法快速準(zhǔn)確，簡便無污染，可用于丹參藥材中隱丹參酮含量的快速測定。

關(guān)鍵詞 聲光可調(diào)-近紅外光譜法；偏最小二乘法；丹參；隱丹參酮

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish rapid method for content determination of cryptotanshinone in Salvia miltiorrhiza. METHODS： The content of cryptotanshinone in sample was determined by HPLC （as reference value）. AOTF-NIDRS combined with PLS was used to establish quantitative correction model for the content of cryptotanshinone in S. miltiorrhiza. According to the results of content determination of cryptotanshinone in samples， 35 samples of medicinal material were collected. First-order derivative combined with smoothing filter coefficient method was used to pretreat spectrum， and optimal band range for content determination of cryptotanshinone in sample ranged 1 250-2 150 nm. RESULTS： Methodology validation of content determination of cryptotanshinone in sample was in line with the requirements. Correction mean square deviation of quantitative correction model of cryptotanshinone was 0.014 6， and predicted mean square deviation was 0.022 3， coefficient of association was 0.976 6. The internal verification deviation was 2.41% and the external verification deviation was 4.06%. CONCLUSIONS： This method is rapid， accurate， simple and pollution-free. It can be used for rapid content determination of cryptotanshinone in S. miltiorrhiza.

KEYWORDS AOTF-NIDRS； Partial least square method； Salvia miltiorrhiza； Cryptotanshinone

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，有活血祛瘀、養(yǎng)血安神、涼血清心的功效，系應(yīng)用歷史悠久的常用中藥[1]。隱丹參酮是丹參的主要脂溶性提取物，有研究證實(shí)其在心血管疾病、代謝紊亂性疾病及神經(jīng)退行性疾病等方面有良好的應(yīng)用前景[2]，而丹參藥材資源分布遍及全國，其質(zhì)量參差不齊。目前，藥品生產(chǎn)單位按2015年版《中國藥典》（一部）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)丹參藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，但步驟復(fù)雜，檢測效率較低。因此，建立一種快速有效的檢測方法對(duì)丹參藥材質(zhì)量控制具有重要意義。

近紅外光譜（Near infrared reflectance spctroscopy，NIR）檢測技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種綠色分析技術(shù)[3]，第5代聲光可調(diào)（Acousto-optic tunable，AOTF）-NIR儀具有體積小、便于攜帶、性能穩(wěn)定，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[4]，可用于在線生產(chǎn)和室外現(xiàn)場。本研究采用AOTF-NIR技術(shù)[5-6]，建立快速測定丹參藥材中隱丹參酮含量的新方法，以期為丹參藥材的快速定量分析提供參考。

1 材料

1.1 儀器

AOTF便攜式Luminar-5030型NIR儀，包括石英檢測皿、樣品旋轉(zhuǎn)器、SNAP光譜分析軟件、CAMO化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件（美國Brimrose公司）；Thermo-U3000型高效液相色譜（HPLC）儀，包括紫外檢測器、Chromeleon7色譜工作站（美國Thermo Scientific公司）；ME204E型萬分之一電子分析天平、MS105DU型十萬分之一電子分析天平（美國Mettler-Toledo公司）；SB-1200D型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑

丹參酮ⅡA對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110766-201520，純度：98.9%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

35批丹參藥材來源于山東、安徽、河南、河北等省區(qū)（見表1），由吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司提供，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)李煥榮教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 隱丹參酮（參考值）測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACE C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.02%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，39%B；6～20 min，39%B→10%B；20～20.5 min，10%B→39%B；20.5～25 min，39%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度為20 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末（過3號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：140 W，頻率：42 kHz） 處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 測定方法 以丹參酮ⅡA為參照，以其相應(yīng)的峰為標(biāo)準(zhǔn)峰，計(jì)算隱丹參酮的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)。隱丹參酮的相對(duì)保留時(shí)間為0.75，校正因子為1.18。

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液，分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，色譜見圖1。結(jié)果表明，供試品色譜圖中，在與丹參酮ⅡA吸收峰相對(duì)保留時(shí)間為0.75的相應(yīng)位置上，出現(xiàn)隱丹參酮吸收峰，該峰分離度>1.5，說明本色譜條件專屬性良好。

2.1.6 方法學(xué)考察 按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果，中間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中丹參酮ⅡA峰面積的RSD均小于1.65%，表明方法精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均較好。

2.1.7 耐用性試驗(yàn) 取藥材樣品（批號(hào)：20140701）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別考察不同色譜柱[Shimadzu Wondacract ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、ALC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、流速（±0.2 mL/min）、檢測波長（±3 nm）、柱溫（±5 ℃）、流動(dòng)相比例（±2%）條件下丹參酮ⅡA的峰面積，各條件平行測試兩次。結(jié)果，不同條件下丹參酮ⅡA峰面積的RSD均小于0.73%，表明本色譜條件在一定波動(dòng)范圍內(nèi)耐用性良好。

2.1.8 藥材樣品含量測定 取35批藥材樣品各適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并按“2.1.4”項(xiàng)下測定方法計(jì)算隱丹參酮含量。結(jié)果，藥材樣品中隱丹參酮含量為0.02%～0.36%，詳見表2（含量測定結(jié)果為去水百分含量）。

2.2 NIR定量模型的建立與驗(yàn)證

2.2.1 NIR的采集 采樣方式：樣品杯固體采樣。采集條件：掃描間隔為2.0 nm，掃描范圍為1 100～2 300 nm，掃描300次[7]。每批藥材樣品采集3張光譜，每次掃描前振蕩樣品杯，藥材樣品的裝樣厚度、裝填的緊密性和顆粒均勻性等在試驗(yàn)中都力求一致。35批藥材樣品近紅外光譜原始疊加圖見圖2。

2.2.2 校正集和驗(yàn)證集樣品的選擇 建模藥材樣品含量范圍和分布情況直接影響校正模型的預(yù)測性能[7]，本研究收集近3年不同產(chǎn)地、批次的丹參藥材共35批，根據(jù)表2藥材樣品中隱丹參酮含量分布情況，從35批藥材樣品中選取30批組成校正集用于建立NIR模型；其余藥材樣品（5批）組成驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證模型。校正集樣本隱丹參酮含量范圍為0.02%～0.36%；驗(yàn)證集樣本隱丹參酮含量范圍為0.02%～0.21%。

2.2.3 光譜預(yù)處理方法的選擇 在建立模型前，需要消除噪音和基線漂移等的影響，采用SNAP光譜分析軟件中的光譜處理程序?qū)υ脊庾V進(jìn)行預(yù)處理。常用的預(yù)處理方法有多元散射校正法（Multiple scatter correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化法（Standard normal variate，SNV）、一階導(dǎo)數(shù)法（First derivative，F(xiàn)D）、二階導(dǎo)數(shù)法（Second derivative，SD）、平滑濾波系數(shù)法（Savitzky-Golay，SG）等。對(duì)各批藥材樣品原始光譜使用不同方法進(jìn)行預(yù)處理，得各處理方法下的校正集內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（R2）、校正均方根偏差（RMSEC）、預(yù)測均方根偏差（RMSEP），詳見表3。

運(yùn)用The Unscrambler分析軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以偏最小二乘法（PLS）建立NIR定量分析模型[8]。選擇R2、RMSEC、RMSEP為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)不同模型的準(zhǔn)確性與適用性。其中，R 2越接近1，NIR預(yù)測值與參考值相關(guān)性越好；RMSEC、RMSEP越小，所建定量分析模型適用性越強(qiáng)、預(yù)測效果越好。結(jié)果表明，采用FD+SG法預(yù)處理光譜可有效消除顏色差別等因素引起的光譜基線偏移和漂移。預(yù)處理后的近紅外光譜見圖3。

2.2.4 建模波段的選擇 建模波段要求包含藥材樣品大量信息的同時(shí)避免冗余信息，降低噪聲干擾。采用FD+SG法對(duì)不同的波段進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化比較，通過The Unscrambler分析軟件得到隱丹參酮含量預(yù)測最佳波段為1 250～2 150 nm，詳見表4。

2.2.5 定量模型的建立 采用FD+SG法預(yù)處理光譜，在“2.2.4”項(xiàng)下波段，運(yùn)用The Unscrambler分析軟件對(duì)校正集30批藥材樣品的隱丹參酮含量進(jìn)行建模。采用光譜影響值Leverage和化學(xué)值誤差Residual等統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)剔除NIR光譜與測定結(jié)果的異常值[8]，進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果，預(yù)測值與參考值的相關(guān)性較高，表明該模型的性能較好，可以用于丹參藥材中隱丹參酮成分的定量分析。校正集樣品NIR模型見圖4。

2.2.6 定量模型的驗(yàn)證 利用校正模型對(duì)5批驗(yàn)正集樣品進(jìn)行驗(yàn)證，將其NIR輸入定量模型，預(yù)測各指標(biāo)含量，再與含量測定參考值進(jìn)行比較，計(jì)算偏差，詳見表5。

3 討論

研究結(jié)果表明，本研究建立的AOTF-NIR法能夠快速、無損地測定丹參藥材中隱丹參酮含量。此前，已有利用NIR技術(shù)快速測定丹參藥材中丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量等的報(bào)道[9-10]，而采用AOTF-NIR技術(shù)對(duì)丹參藥材中隱丹參酮進(jìn)行快速檢測的研究尚未報(bào)道。本研究建立了丹參藥材中隱丹參酮含量NIR快速檢測模型，完善了丹參藥材的快速檢測體系，為全面控制丹參藥材質(zhì)量提供了可行方案。

本課題目的為制藥生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)控實(shí)際品種提供技術(shù)支持，常規(guī)測定每批次藥材樣品約需4～7 h，本研究采用AOTF-NIR建立的模型，對(duì)藥材樣品僅進(jìn)行粉碎處理，縮短了檢測周期、減少了耗材的使用、降低了檢測成本。若進(jìn)一步增加藥材樣本數(shù)量，擴(kuò)大其覆蓋范圍，可以建立更加穩(wěn)定的模型[11]。

綜上，本研究建立的AOTF-NIR法所得預(yù)測結(jié)果較為準(zhǔn)確，能夠滿足生產(chǎn)中丹參藥材檢查需求。雖然NIR法的準(zhǔn)確度不及HPLC法，但因其快速、準(zhǔn)確、無污染，能滿足工業(yè)生產(chǎn)中大批量采集藥材樣品化學(xué)信息的需求，適用于快速測定藥材中成分，亦可拓展多指標(biāo)同時(shí)檢測，可與法定標(biāo)準(zhǔn)一起構(gòu)建準(zhǔn)確、便捷、普適性強(qiáng)的中藥材整體質(zhì)量快速評(píng)價(jià)方法體系，對(duì)保障最終制劑產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可控具有重要意義。

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（收稿日期：2017-07-04 修回日期：2017-08-17）

（編輯：張 靜）