糧食中赭曲霉毒素A檢測技術(shù)的研究

李皖光　張黎利　王新文

[摘要]本研究對(duì)糧食中赭曲霉毒素A（OTA）的常用檢測方法進(jìn)行了考察，主要考察了高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和膠體金免疫快速定量檢測法（GICT）的檢測限（LOD）和定量限（LOQ），通過適用的線性范圍和精確度等因素，分析了三種檢測方法的優(yōu)劣，為滿足日益變化的檢測需求提供了參考。

[關(guān)鍵詞]赭曲霉毒素A；高效液相色譜法；酶聯(lián)免疫吸附測定法；膠體金免疫快速定量檢測法

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180811

赭曲霉毒素A（OTA）是由多種生長在糧食（小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米等）、蔬菜等農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生的。目前，小麥、大麥、玉米等谷類作物中OTA的測定方法有薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）和膠體金免疫快速定量檢測法（GICT）。本研究對(duì)常用的三種檢測方法即HPLC、ELISA和GICT進(jìn)行了考察，從儀器、人員和時(shí)間等多方面論證了三種檢測方法的優(yōu)劣，從最低檢出限、定量限、回收率、精密度和重復(fù)性等參數(shù)分析了三種檢測方法的精確度，為日益復(fù)雜的檢測需求提供了多種選擇。

1材料與方法

1.1材料與試劑

小麥粉五個(gè)不同梯度的OTA參考物質(zhì)：美國Charm公司；OTA的GICT試劑盒：美國Charm公司；HPLC免疫親和柱：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈，色譜純：上海安譜化學(xué)試劑有限公司；OTA的ELISA試劑盒：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（配備熒光檢測器，型號(hào)為LC-30AD）：島津（上海）有限公司；MK3酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ROSA-M孵育器和讀數(shù)儀：美國Charm公司；離心機(jī)：鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；旋渦混勻器：德國IKA公司；錘式旋風(fēng)磨：波通瑞華科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3樣品檢測方法

HPLC，參照GB/T23502-2009《食品中赭曲霉毒素A的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》，結(jié)合免疫親和柱的使用說明；ELISA，參照GB/T 19539-2004《飼料中赭曲霉毒素A的測定》，結(jié)合試劑盒生產(chǎn)廠家提供的操作說明；GICT，參照試劑盒生產(chǎn)廠家提供的操作步驟和讀數(shù)方法。

2結(jié)果與分析

2.1線形范圍的確立

2.1.1 HPLC的線性范圍

小麥赭曲霉毒素A的HPLC與標(biāo)準(zhǔn)值線性關(guān)系見圖1。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值作為橫坐標(biāo)，HPLC的檢測結(jié)果（實(shí)測值）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為0～61.34μg/kg時(shí)，線性回歸方程為y=0.9171x+0.4273，相關(guān)系數(shù)R=0.9999。

2.1.2 ELISA的線性范圍

小麥赭曲霉毒素A的ELISA與標(biāo)準(zhǔn)值線性關(guān)系見圖2。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值作為橫坐標(biāo)，ELISA的檢測結(jié)果（實(shí)測值）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為0～61.34μg/kg時(shí)，線性回歸方程為y=1.100 9x-0.4716，相關(guān)系數(shù)R=0.9999。

2.1.3 GICT的線性范圍

小麥赭曲霉毒素A的GICT與標(biāo)準(zhǔn)值線性關(guān)系見圖3。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值作為橫坐標(biāo)，GICT的檢測結(jié)果（實(shí)測值）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為0～61.34μg/kg時(shí)，線性回歸方程為y=1.033 4x-0.8733，相關(guān)系數(shù)R=0.9985。

2.2方法測定低限

根據(jù)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》，用陰性樣品連續(xù)測定24次后，計(jì)算出24次測定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。再根據(jù)檢測限（LOD）=平均值+2×SD，計(jì)算檢測限；定量限（LOQ）=平均值+10×SD，計(jì)算定量限。

通過實(shí)驗(yàn)測定，三種方法的檢測限值均小于1μg/kg，符合檢測限要求。綜合檢測方法所給出的檢測限值，HPLC的檢測限為0.21μg/kg，ELISA的檢測限為0.23μg/kg，GICT的檢測限為0.64μg/kg；綜合檢測方法所給出的定量限值，HPLC的定量限為0.85μg/kg，ELISA的定量限為0.79μg/kg，GICT的檢測限為2.88μg/kg。測試數(shù)據(jù)見表1。

2.3方法精密度

參照GB/T 27404-2008的有關(guān)精密度的規(guī)定，選擇6個(gè)參與測試的人員在相同實(shí)驗(yàn)室，按照同一方法，采用不同設(shè)備，檢測相同樣品，進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證。本研究選取了三個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為待測樣品，三種方法的變異系數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較見表2。

2.4方法準(zhǔn)確度

參照GB/T 27404-2008的有關(guān)準(zhǔn)確度的規(guī)定，將有證參考物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值作為認(rèn)定值，三種OTA檢測方法的平行測定結(jié)果的平均值與之比較，根據(jù)正確度=檢測值/認(rèn)定值×100計(jì)算。正確度為84.3%～105.5%，平均為97%，符合標(biāo)準(zhǔn)中不同水平的規(guī)定，具體結(jié)果見表3。

3結(jié)論

通過對(duì)這三種檢測方法的對(duì)比研究，可以得出以下結(jié)論：三種OTA的檢測方法檢測限和定量限均小于1μg/kg，精密度和準(zhǔn)確度均符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的一般要求，可以作為定量的檢測方法。

HPLC法需要的試劑較多，需要接觸OTA的標(biāo)準(zhǔn)品，使用的免疫親和柱也需要冷藏保存，需要避免移動(dòng)色譜儀，便攜性不強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長。但是該方法的重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，因此國家標(biāo)準(zhǔn)中推薦使用此方法。

ELISA法需要的儀器和設(shè)備不多，試劑盒需要冷藏保存，接觸到的標(biāo)準(zhǔn)品一般濃度較低甚至沒有。酶標(biāo)儀可以攜帶，一次可以檢測大批量的樣品，適合于樣品的初步篩選。

GCIT法所需要的孵育器和讀數(shù)儀體積不大，一般不需要接觸標(biāo)準(zhǔn)品，具有一定的優(yōu)勢(shì)，但是其精確度相比較略差，適用于樣品的現(xiàn)場檢測和篩選。