基于HPLC—DAD法及響應曲面法的稻谷葉黃素含量測定方法研究

顧佳緣 王琰 胡慧敏等

[摘要]本研究采用HPLC-DAD法，在單因素試驗的基礎上，用響應曲面法（RSM）對影響稻谷中葉黃素提取效果的四氫呋喃用量、KOH甲醇溶液質量濃度和提取溫度三個因素進行優化，建立各因素與葉黃素提取量關系的數學模型。響應曲面法優化稻谷中葉黃素最佳提取方法為四氫呋喃15.5mL、KOH甲醇溶液質量濃度0.1g/mL、提取溫度51℃，稻谷中葉黃素提取量為（1.63±0.03）μg/g。運用HPLC-DAD及響應曲面法可有效縮短稻谷中葉黃素提取時間，為高效提取稻谷中的葉黃素提供了參考。

[關鍵詞]稻谷；葉黃素；響應曲面法；HPLC-DAD

中圖分類號：TS210.1 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180808

葉黃素屬于類胡蘿卜素，分子式為C₄₀H₅₆O₂，結構上由兩個六元碳環和一個含有十八個碳原子的共軛雙鍵長鏈組成。葉黃素是眼部黃斑區的抗氧化劑，對老年性眼球視網膜黃斑退化、動脈硬化、白內障、心血管疾病等有預防作用，同時也可預防癌癥以及紫外線對皮膚的損傷。成熟收獲后的稻谷中含有游離的葉黃素和葉黃素酯，主要存在于最外層的果皮、胚芽和糊粉層中。人體對葉黃素酯及酯類衍生物的吸收率較差，必須先轉化為游離的葉黃素才能被人體吸收。隨著消費者個性化需求越來越明顯，消費觀念日趨理性，人們逐漸意識到富含葉黃素等微量營養素的稻米營養更豐富，研究和檢測稻米中的微量營養素也逐漸受到學者的重視。

Maelle等借助HPLC-UV法及響應面法（RSM）對葉黃素提取參數進行優化，取得了較好的提取效果。Boonnoun等使用液化二甲醚，配合HPLC-DAD法，提高了萬壽菊花中游離葉黃素的提取率。Fan等利用超臨界CO₂及HPLC，研究提取葉黃素的最佳條件，并建立模型提高葉黃素提取率。Cobb等采用HPLC-PDA法及響應面法確定了玉米蛋白粉中葉黃素的最佳提取條件，并認為葉黃素和玉米黃質的提取量是強相關。Pal等應用HPLC法和響應面法試驗設計優化提取參數，確定了黃玉米粒中葉黃素的最佳提取方法。

但是目前很少有對稻谷中微量葉黃素檢測的研究。葉黃素在提取過程中會受到有機溶劑及用量、KOH甲醇溶液質量濃度及用量、提取溫度、提取時間及抗氧化劑BHT添加量的影響，各個因素對葉黃素提取量的影響不同。本研究通過運用HPLC-DAD法定量檢測稻谷中葉黃素的含量，采用響應曲面法優化各個提取條件，并建立各因素與葉黃素提取量關系的數學模型，確定最佳提取方法，為高效提取與測定稻谷中葉黃素提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗材料

稻谷（華梗5號）：宿州；葉黃素標準品（97%）：美國Sigma公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四氫呋喃（THF）：天津市致遠化學試劑有限公司；甲醇、正己烷、乙酸乙酯（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鉀：西隴科學股份有限公司。

1.1.2儀器

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀（配有光電二極管陣列檢測器DAD）：戴安中國有限公司；高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽：上海一恒科技有限公司；電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；N-1100D-WD旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；BLH-3250實驗礱谷機：浙江伯利恒儀器設備有限公司。

1.2葉黃素提取與色譜分析條件

1.2.1葉黃素提取

稱取一定量的稻谷樣品于礱谷機中去殼，倒入粉碎機中碾磨成粉。精確稱取1g稻谷粉，按實驗條件分別添加有機試劑、KOH甲醇溶液和BHT后避光振蕩一段時間。過濾后的殘渣重復提取一遍，合并兩次上清液于50mL離心管中。以5000r/min離心20min，轉移清液至另一離心管中，重復操作一次，合并上清液，于旋轉蒸發儀上50℃蒸至近干，殘留物溶于2mL甲醇中，過0.45μm微孔濾膜備用。上述操作均在避光條件下進行。

1.2.2色譜分析條件

色譜柱YMC-C30：4.6×250mm，5μm；檢測波長：445nm；柱溫：35℃；流動相：甲醇：水=95：5，等梯度洗脫；流速：0.8mL/min；進樣量：20μL。

1.3標準曲線的繪制

用電子天平精確稱取葉黃素標品5mg置于50mL棕色容量瓶中，用色譜級甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度為50μg/mL的標準溶液。精密移取0.5mL、1mL、2mL.4mL、6mL、8mL、10mL溶液至50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度并搖勻，制得濃度分別為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL.4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg//mL的標準溶液，充氮備用。操作在昏暗條件下進行，每個系列濃度進樣三次，按照上述色譜條件測定標準葉黃素的峰面積，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X）繪制標準曲線。

1.4單因素試驗

本試驗主要考慮不同的有機試劑及用量、KOH甲醇溶液質量濃度及用量、提取溫度和時間以及抗氧劑BHT用量對稻谷中葉黃素提取量的影響，用葉黃素提取量評價試驗效果。

初始條件設為有機溶劑用量10mL，KOH甲醇質量濃度為0.2g/mL，用量5mL，提取溫度為40℃，提取時間為2h，BHT添加量為0.2g，研究甲醇、四氫呋喃、正己烷和乙酸乙酯對稻谷中葉黃素提取效果的影響。取上述實驗的最佳有機溶劑，溶劑用量分別設為5mL、10mL、15mL、20mL，探究有機溶劑用量對稻谷中葉黃素提取量的影響。

在上述試驗的基礎上，設置KOH甲醇溶液質量濃度分別為0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL。探究KOH甲醇溶液質量濃度對稻谷中葉黃素提取量的影響。繼而分別選取KOH甲醇溶液用量5mL、10mL、15mL、20mL、25mL，探究KOH甲醇溶液用量對稻谷中葉黃素提取量的影響。

選取最佳有機溶劑及用量、KOH甲醇溶液質量濃度及用量，將提取溫度設為30℃、40℃、50℃、60℃，探究提取溫度對稻谷中葉黃素提取量的影響。選取最佳提取溫度，將提取時間設為1h、2h、3h、4h，探究提取時間對稻谷中葉黃素提取量的影響。將抗氧化劑BHT的添加量分別設為0g、0.2g、0.4g、0.6g，探究BHT添加量對稻谷中葉黃素提取量的影響。

1.5稻谷中葉黃素提取量的計算

在445nm處測出峰面積，代入標準曲線得出質量濃度C，根據公式計算葉黃素提取量。

式中，C為稻谷中葉黃素的質量濃度，單位為μg/mL；V為定容體積，單位為mL；M為稻谷質量，單位為g。

1.6響應曲面法優化稻谷中葉黃素提取方法

在單因素試驗的基礎上，選取三個主要因子X₁、X₂、X₃進行響應曲面試驗設計，以葉黃素的提取量為響應值進行三因素三水平試驗，運用Design Expert10.0.7軟件進行回歸分析，確定稻谷中葉黃素的最佳提取方法。

1.7數據處理

每次測定至少重復3次，實驗數據以（平均值±標準差）表示，實驗數據處理使用Design Expert 10.0.7，采用Graphpad Prism7.0等軟件進行處理及制圖。

2結果與分析

2.1 HPLC-DAD法建立葉黃素標準曲線

根據色譜分析條件，繪制出葉黃素標準曲線，具體見圖1。線性回歸方程為y=1.348 4x-0.1749（R²=0.9995），葉黃素標準品濃度在0.5～50μg/mL時與峰面積呈良好的線性關系。

2.2回收率及精密度測定

精密度：取同一稻谷，進行葉黃素提取，連續測定6次，計算出葉黃素提取量的RSD為0.25%，表明精密度良好。

重復性：取同一批稻谷，稱取6份同一樣品進行提取，計算出葉黃素提取量的RSD為0.47%，表明重復性良好。

穩定性：取同一批稻谷，在0h、2h、4h、6h、8h各測定一次，計算出葉黃素提取量的RSD為1.22%，表明樣品溶液在8h內基本穩定。

取6份處理好的稻谷，分別滴加1μg/mL的葉黃素對照品1mL，經液相進行測定，并計算回收量，加樣回收實驗結果見表1。試驗所得平均回收率為98.38%，表明該方法具有較好的回收率。

2.3單因素試驗結果

在查閱文獻的基礎上，結合實驗試劑的安全性，選定四種試劑，分別為甲醇、四氫呋喃、正己烷、乙酸乙酯，不同有機溶劑對稻谷中葉黃素提取量的影響結果見圖2。由圖2可知，不同溶劑對葉黃素的提取量存在顯著差異（P<0.05）。選取四氫呋喃作有機溶劑時，稻谷中葉黃素的提取量最高，為（1.54±0.03）μg/g，正己烷、乙酸乙酯次之，甲醇最低。因此，選取四氫呋喃作為提取稻谷中葉黃素的有機溶劑。

不同條件對稻谷中葉黃素提取量的影響見圖3。

由圖3（a）可知，四氫呋喃用量對稻谷中葉黃素的提取量影響較小。原因是稻谷中游離的葉黃素含量少，四氫呋喃對葉黃素的溶解性較好，可對稻谷中的葉黃素充分溶解。據Yuhas等的研究顯示，加入四氫呋喃有利于將葉黃素與脂肪分開，提高葉黃素提取效率和回收率。另外，四氫呋喃的沸點較低，易通過旋轉蒸發除去。考慮到節約實驗試劑的原則，選取四氫呋喃的用量為15mL，此時葉黃素提取量為（1.56±0.02）μg/g。

由圖3（b）可知，隨著KOH甲醇溶液質量濃度的增加，稻谷中葉黃素的提取量先增加后減少，這是由于葉黃素與溶劑的接觸面濃度差增加，滲透壓增大，葉黃素更容易浸出。當質量濃度過高時，溶液中堿性增加，破壞了葉黃素在溶液中的穩定性；質量濃度為0.15g/mL時，提取量達到最大，為（1.58±0.06）μg/g，最終選定KOH甲醇溶液質量濃度為0.15g/mL。

由圖3（c）可知，當KOH甲醇溶液用量為5～10mL時，葉黃素的提取量逐漸升高，高于10mL后，開始有較大幅度的下降。主要原因是隨著溶液用量的增加，溶液中過強的堿性影響葉黃素的穩定性，造成提取過程中的損失，最終選定KOH甲醇溶液用量為10mL。

由圖3（d）可知，稻谷中葉黃素的提取量隨著溫度的上升而增加，葉黃素提取量隨溫度變化規律與Kang等的研究一致。當溫度到達50℃后，葉黃素中有不飽和鍵，過高的溫度易導致葉黃素分解和異構化，此時不利于葉黃素的提取，所以選擇提取溫度為50℃。

由圖3（e）可知，提取時間對稻谷中葉黃素提取量的影響是先增加后減少。一開始隨著時間的增加，稻谷中游離的葉黃素可充分溶解并提取，當提取時間到達2h后，提取體系中持續存在的高溫環境，使得葉黃素發生異構化，影響最后的提取量，所以選取最佳提取時間為2h。提取溶液中，溶液酸堿性復雜，在酸性條件下，H⁺與葉黃素的羥基發生反應，使葉黃素降解，添加抗氧化劑可以保持葉黃素在溶劑中的穩定性。

由圖3（f）可知，添加0.2gBHT與沒有添加BHT相比，提取量提高了14.5%。在添加BHT之后，添加量沒有對葉黃素提取量產生明顯的改變，最終選定BHT添加量為0.2g。

2.4響應曲面法優化稻谷中葉黃素提取方法

在2.3單因素試驗結果上，對四氫呋喃用量（X₁）、KOH甲醇溶液質量濃度（X₂）、提取溫度（X₃）3個因素進行響應曲面試驗設計。設響應曲面因素與水平及編碼值見表2，響應曲面法優化稻谷中葉黃素提取方法見表3。

利用Design Expert對表3中的數據進行二次多元回歸擬合，得到葉黃素提取量（Y）對X₁、X₂、X₃的二次多元回歸方程：

2.5試驗因素交互作用分析

2.5.1四氫呋喃用量和KOH甲醇溶液質量濃度

四氫呋喃用量和KOH甲醇溶液質量濃度對稻谷中葉黃素提取量影響的響應面（a）和等高線（b）見圖4。如圖4所示，固定提取溫度為50℃，四氫呋喃用量不變，當KOH甲醇溶液質量濃度在0.05～0.1g/mL時，稻谷中葉黃素的提取量隨質量濃度的增加而增加；KOH甲醇溶液質量濃度大于0.1g/mL后，葉黃素的提取量逐漸下降；KOH甲醇溶液質量濃度一定時，隨著四氫呋喃用量的增加，葉黃素提取量先增加后減少。

2.5.2四氫呋喃用量和提取溫度

四氫呋喃用量和提取溫度對葉黃素提取量影響的響應面和等高線見圖5。如圖5所示，固定KOH甲醇溶液質量濃度為0.1 g/mL，當提取溫度一定時，稻谷中葉黃素提取量隨四氫呋喃用量的增加而增加，到達峰值后，葉黃素提取量緩慢下降；當四氫呋喃用量不變時，提取量隨溫度的上升而增加，在溫度到達50%后，葉黃素提取量隨溫度上升而逐漸下降。

2.5.3 KOH甲醇溶液質量濃度和提取溫度

KOH甲醇溶液質量濃度和提取溫度對稻谷中葉黃素提取量影響的響應面（a）和等高線（b）見圖6。如圖6所示，固定水平為四氫呋喃用量15mL，當提取溫度不變，KOH甲醇溶液質量濃度在0.05～0.1g/mL時，稻谷中葉黃素的提取量隨KOH甲醇溶液質量濃度的增加而快速提高；當KOH甲醇溶液質量濃度大于0.1g/mL時，葉黃素的提取量快速下降；在KOH甲醇溶液質量濃度恒定時，隨著溫度的升高，稻谷中葉黃素的提取量不斷增加；當溫度高于50%時，葉黃素提取量呈現下降的趨勢。

2.6稻谷中葉黃素提取方法的確定

響應曲面優化值結果見表6。由表6可知，響應曲面優化后的最佳提取方法為四氫呋喃用量15.39mL、KOH甲醇溶液質量濃度0.1g/mL、提取溫度50.69℃，理論最大值為1.61μg/g。為驗證響應曲面法結果的可靠性，考慮到實際操作過程中的便利性，對理論最優值調整為四氫呋喃用量15.5mL、KOH甲醇溶液質量濃度0.1g/mL、提取溫度51℃，以此作為最佳提取方法條件并重復實驗，結果見表7。

由表7可知，3次測定取平均值為（1.63±0.03）μg/g，與理論值1.61相近（相對誤差1.22%），說明該回歸模型具有較好的擬合度。響應面法確定的最佳提取方法下，實際葉黃素提取量比單因素條件下有所提高，這與楊秋明等的研究結果一致。通過在實際操作中優化各因素條件，最終葉黃素提取量與回歸模型具有較好的擬合度，說明模型具有較好的參考價值。

3結論

本文探討了基于HPLC-DAD稻谷中葉黃素的提取方法，通過單因素試驗確定了各個因素的最佳條件。應用響應曲面法對四氫呋喃用量、KOH甲醇溶液質量濃度和提取溫度三個因素進行優化，建立具有良好擬合度的回歸模型，得到最佳的提取方法為四氫呋喃用量15.5mL、KOH甲醇溶液質量濃度0.1g/mL、提取溫度51℃，稻谷中葉黃素提取量為（1.63±0.03）μg/g。該方法縮短了反應時間，避免了游離葉黃素的分解和異構化，具有較好的重復性。