熱休克培養對bFGF轉染骨髓間充質干細胞FGFRs及凋亡相關蛋白的影響

李錦

作者單位：福建省老年醫院/福建醫科大學教學醫院心血管內科，福建 福州 350003

堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF)在人體中相對重要，能發揮多種生物效應，用于骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）中能促進細胞的增殖、分化，并且還能促進血管生成[1]。BMSCs是目前組織工程學中的研究熱點，該細胞分離相對容易，能實現細胞的擴增培養，是基因治療中離心的載體細胞[2-3]。研究表明[4-5]：熱休克培養有助于實現bFGF轉染到BMSCs，并提高BMSCs中FGFRs的表達，但是該結論有待驗證。因此，本研究以2016年5月—2018年1月進行實驗的4周齡雄性SD大鼠10只，探討熱休克培養對bFGF轉染BMSCs后FGFRs及Bax、Bcl-2和Caspase-3等凋亡相關蛋白表達的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年5月—2018年1月進行實驗的4周齡雄性SD大鼠10只，清潔級，檢疫合格，體質量160～220 g，平均（200±15）g。所選動物均由醫學動物實驗中心常規飼養，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食，試驗均通過醫院動物委員會批準同意。

1.2 方法

（1）BMSCs的獲取與培養。將入組大鼠以頸椎脫臼方式處死，完整取下分離股骨、脛骨，采用PBS進行反復注入骨髓腔中，直到骨髓腔轉白，制備細胞懸液，將其接種在25 cm2培養瓶中貼壁生長，傳代培養[6-7]。

（2）bFGF基因腺病毒表達載體的構建與BMSCs的轉染。構建bFGF基因過表達的腺病毒表達載體Ad-bFGF及空載體Ad-GFP，將其集中在12孔培養板中（滴度范圍為50～500），轉染BMSCs，步驟如下：將獲得的BMSCs放入培養箱中進行24 h熱休克培養，BMSCs經過熱處理后放置在43℃水浴中進行30 min孵育，并且在24 h、48 h完成標本的收集。取第二代細胞胰酶消化后放置在6孔板中，控制每孔細胞數量為5×105，分別轉染Ad-bFGF和Ad-GFP，命名為轉染Ad-bFGF組、空載體Ad-GFP組，同時設立未轉染組為陰性對照組。采用qRT-PCR和Western blot法分別鑒定3組細胞bFGF基因及蛋白的表達情況[8]。

（3）Western blot法 檢 測 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋 白表達的表達情況：缺氧處理后，用RIPA裂解液裂解三組細胞200 μL/孔，冰上裂解20 min，輔以細胞刮均勻刮下細胞，邊刮邊裂解，20 min后用槍頭吸取裂解液轉移至EP管中，做好標記，BCA試劑盒蛋白定量后，進行一抗及二抗孵育，SDS-PAGE系統電泳轉膜后加入一抗，包括 Bcl-2（1∶ 500）、Bax（1∶ 500）、Caspase-3（1∶ 500）、β-actin（1∶ 4 000），二抗為 HRP 標記抗體（1∶ 5 000）。加ECL發光液、曝光、顯影。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件處理，計量資料行t 檢驗，采用表示P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR和Western blot法檢測bFGF基因和蛋白在3組細胞中表達情況

轉染后48 h，RT-PCR法檢測bFGF mRNA在3組細胞中的表達，電泳結果顯示，只有轉染Ad-bFGF組細胞出現bFGF mRNA條帶，陰性對照組與空載體Ad-GFP組細胞均未出現，說明轉染Ad-bFGF組細胞mRNA水平上有表達bFGF基因（圖1A）。Western blot法檢測bFGF蛋白在3組細胞中的表達，結果發現，只有轉染Ad-bFGF組細胞中有bFGF蛋白的表達，而陰性對照組與空載體Ad-GFP組細胞中均未檢測到此蛋白，說明轉染AdbFGF組細胞高效表達bFGF蛋白（圖1B）。上述結果表明，熱休克培養，腺病毒表達載體Ad-bFGF成功轉染BMSCs。

2.2 Western blot法檢測 bFGF轉染 BMSCs對FGFRs、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

圖1 3組細胞bFGF基因和蛋白的表達情況

圖2 Western blot法檢測三組細胞FGFRs、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達

轉染后，轉染Ad-bFGF組較陰性對照組、空載體Ad-GFP組，FGFRs、Bcl-2蛋白表達增加，而Bax、Caspase-3蛋白表達下降，Bax/Bcl-2比值下降（P均＜0.05），而陰性對照組與空載體Ad-GFP組之間差異無統計學意義（P＞0.05），如圖2。

3 討論

BMSCs已逐步應用于治療缺血性心肌病，但實驗及臨床上BMSCs移植后存活率較低，系制約其推廣應用的主要因素之一。因此如何選擇合適的基因對BMSCs進行相應的修飾，有效提高干細胞移植的存活率，是突破臨床應用限制瓶頸重點。在大量實驗文獻中，FGF基因修飾的BMSCs具有促進新生血管的生成、改善心肌重塑、調節心肌細胞有序生長，提高心肌梗死后心功能，但對bFGF轉染BMSCs后凋亡相關蛋白表達調控未行進一步研究，因此本實驗探索經熱休克處理后bFGF修飾BMSCs表達凋亡相關蛋白的情況。

FGF系心臟功能中重要的調節信號通路之一，它具有抗冠狀動脈硬化、抗心肌重構的作用，并調控血管舒張收縮、改善左室功能，影響著在多種內在器官的形態、分化、功能，能促進干細胞向心肌細胞分化、增殖，通過自分泌及旁分泌的方式調節心肌細胞發育成熟，國外曾有學者[9]通過剔除小鼠FGF基因后，小鼠左室質量指數下降，心肌細胞同樣減少，也表明了FGF具有促心肌細胞增殖的作用。bFGF與血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）均能促進血管的形成，能直接參與細胞的增殖、生長[10]。國內學者研究表明[11]：當內源性bFGF水平上升時，細胞在進行培養時VEGF水平提高，有助于促進血管的形成。通過熱休克培養（如：加熱、光照等方式）能誘導彈性蛋白原過度表達，能提高FGFRs蛋白表達水平[12]。本研究中，經熱休克培養后,轉染Ad-bFGF組有bFGF基因和蛋白表達，而陰性對照組和空載體Ad-GFP組未檢測到此基因和蛋白。Western blot結果表明：轉染Ad-bFGF組FGFRs表達顯著增高，高于陰性對照組和空載體Ad-GFP組（P＜0.05）。由此看出：將熱休克培養用于bFGF轉染BMSCs中能提高FGFRs表達水平，能提高基因誘導分化率，利于促進血管的生成，能為臨床基因靶向治療提供思路和方法[13]。

細胞凋亡是由一系列相關分子調控機制相互協調的復雜過程，有多種凋亡相關基因參與其中，目前研究最多、最熱門的是Bcl-2。Bcl-2是一個調控細胞凋亡的超家族，在細胞凋亡信號轉導中發揮重要的作用。其中促進細胞凋亡的Bax基因和抑制細胞凋亡的Bcl-2基因，是超家族中最具代表性的成員，兩者作用相反，相互拮抗，共同調節細胞凋亡，以二聚體的形式發揮作用。Bax/Bcl-2的比例決定了細胞的生存或凋亡，當凋亡因素啟動時，兩者比值增高，則細胞凋亡，反之，細胞存活。但目前二者的具體作用機制尚不完全明確，可能與誘導促凋亡因子細胞色素C，進而激發Caspase-3活性有關[14]。在本實驗中可見，干預組中Bax/Bcl-2比值低于空白組、陰性對照組（P＜0.05），提示干預后干細胞抗凋亡能力提升。

Caspases又被稱為凋亡蛋白酶，系細胞凋亡中具有重要調節作用的酶系家族，是細胞凋亡終結者，在細胞內激活或過表達均可誘導細胞的凋亡，在整個凋亡過程中起到關鍵的作用。Caspases基因激活后通過逐步形成級聯反應誘導凋亡，其中Caspase-3處于級聯反應的最下游，是誘導細胞凋亡最終發生的執行者，在多種因素誘導凋亡過程中其到樞紐作用。經典的細胞凋亡途徑分為2條，包括細胞外途徑和細胞內凋亡途徑[11]。在細胞外途徑過程中，死亡配體和相對應的受體結合形成死亡信號，接著再與信號傳導分子相連接，進一步和Caspase-8結合，形成死亡誘導信號復合物，從而使Caspase-8活化，當Caspase-8直接與Caspase-3發生作用，Caspase-3被激活，進而誘導細胞凋亡[15]。而細胞內途徑也稱為線粒體途徑，在此途徑中，凋亡刺激因子與凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）形成多聚復合物，然后胞質中的Caspase-9前體結合，形成巨大復合物，巨大復合物引起Caspase-9前體活化，再激活下游的Caspase-3，從而發生級聯反應，最后誘導細胞凋亡。Caspase-3一方面通過調控凋亡相關的特異性細胞蛋白，導致凋亡發生，另一方面通過抑制DNA修復蛋白，抑制DNA修復，促進細胞凋亡。本實驗結果顯示轉染Ad-bFGF組中Caspase-3表達水平最低，低于空白組、陰性對照組（P＜0.05）。

綜上所述，利用腺病毒介導的基因轉染技術能實現bFGF轉染到BMSCs中，通過熱休克培養能提高FGFRs蛋白水平，有望將其作為基因治療的理想載體，并改善干細胞活性，降低Bax/Bcl-2比值，進而減少Caspase-3激活和表達，降低凋亡比例，發揮抗凋亡作用，因此，bFGF轉染BMSCs可提高移植療效，在缺血性心肌病、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病治療方面具有可預期的前景，但本實驗受限于時間、資金等原因，尚有待進一步完善和深入研究。