基于高通量測序技術的濃香型和芝麻香型白酒酒曲細菌群落結構分析

李 斌，閆志鵬，李慧星，李紹亮，李學思，郭書賢*

（1.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004；2.河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；3.河南省宋河酒業股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

酒曲作為白酒釀造的原動力，直接影響到白酒的品質。根據制曲溫度的不同，可分為高溫大曲（60～65℃）、中高溫大曲（55～60℃）、中溫大曲（50～55℃）和低溫大曲（40～50℃）[1]。大曲中的主要微生物是細菌、霉菌和酵母，根據微生物的種類和生活習性的不同，在酒曲的制作中，保持酒總體風格的同時，要盡量兼顧各種微生物生長需要的適宜的溫度、濕度、pH、氧氣等，為微生物的生長繁殖創造一個良好的外界環境[2]。濃香型酒曲的細菌主要是乳酸細菌、芽孢桿菌和醋酸細菌，其中芽孢桿菌多數屬于耐熱的芽孢桿菌屬[3]。

傳統的平板培養或變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）等技術只能對大曲中少數可以分離培養的菌種進行研究，具有很大的局限性，而高通量測序技術具有高通量、高分辨率的優勢，為準確揭示微生物菌群的多樣性提供了強有力的手段，能夠充分展示微生物菌群的多樣性[4]。目前，Rocher 454、Illumina和Iontorrent是廣泛應用的高通量測序平臺，Miseq是Illumina開發的第二代高通量測序技術，具有成本低、準確率高、操作簡便的優點，已被廣泛且成功地應用于食品[5]、土壤[6-7]、水資源[8]等的微生物菌群分析。但目前應用高通量測序技術對白酒釀造大曲的細菌的研究報道還比較少，只有陳玲等[9]以濃香型白酒大曲為研究對象，基于16S rRNA基因為目的片段，分別采用微生物指紋圖譜分析技術16S rDNA克隆文庫法和高通量測序法分析了大曲中細菌微生物群落的組成，得出大曲中的微生物主要分布于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacteria/Chloroplast）4個菌門。劉延波等[10]采用高通量測序技術分析了濃香型白酒中溫曲和高溫曲的細菌群落結構，發現中溫曲中細菌主要分布于厚壁菌門，變形菌門，藍藻菌門；高溫曲中主要分布于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、藍藻菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）和異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）。

因此，本研究采用高通量測序技術，利用Illumina公司Miseq測序平臺對濃香型白酒的中高溫曲和芝麻香型白酒的高溫曲進行研究，分析了兩種大曲在白酒釀造過程中主要的細菌構成，建立一套高通量測序技術分析白酒大曲細菌的方法，同時通過數據分析，完整的解析兩種大曲中細菌的群落結構。為建立濃香型白酒大曲和芝麻香型白酒大曲的微生物信息數據庫，優化大曲的發酵工藝和提升品質提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒中高溫大曲1月齡（Z1）、2月齡（Z2）、4月齡（Z3），芝麻香型白酒高溫曲（AA1）：河南省宋河酒業股份有限公司。樣品采集后迅速粉碎密封，-20℃保存備用。

1.1.2 主要試劑

Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：美國Thermo公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設備

Mastercycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Eppendorf公司；Pico-21臺式離心機：美國Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：拓能達科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；GelDoc-ItTS3凝膠成像系統：美國UVP公司；Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

酒曲中微生物總DNA提取按照OMEGA試劑盒說明書中的方法和步驟進行。

1.3.2 聚合酶鏈式反應及測序

PCR擴增細菌16S rDNA的V3～V4區域。

PCR引物：Miseq測序平臺的通用引物[11]（341F：5'-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG-3'，805R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。

PCR擴增反應體系：10×PCR buffer（5 μL），脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（0.1 mmol/L），Genomic DNA（10 ng），341F（0.5 μmol/L），805R（0.5 μmol/L），PlantiumTaq（0.05 U），用雙蒸水補充至50 μL。

PCR擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s，共計5個循環；然后進行94℃變性20s，45℃退火20s，65℃延伸30s，共計20個循環；最后72℃延伸5 min。

PCR產物進行瓊脂糖電泳，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對DNA回收。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA進行精確定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 數據分析

測序獲取原始序列，將雙末端序列融合為一個方向的序列并進行質量控制（quality control，QC）。

（1）序列融合，采用Flash1.2.3軟件融合雙末端序列，通過各樣品的barcode使數據回歸樣品，并對各樣品序列做質量控制。

（2）QC分為4個步驟：采用V0.20.4 Prinseq軟件對序列閱讀框的3'端進行質控，截掉Q值（堿基質量值）低于20的數據，提高后續序列融合比率；通過Flash軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列；采用Prinseq軟件去除各樣品的引物序列、低于200 bp的序列、低復雜度序列和低質量序列；去除非靶區域序列及嵌合體，首先采用1.30.1Mothur軟件的Pre.cluster模塊校正測序錯誤，校正過程當中允許的最大錯配為1/150。其次，采用軟件Mothur內的Uchime功能模塊，以Silva數據庫中的序列作為模板，去除嵌合體及非靶區域序列。

2 結果與分析

2.1 序列的拼接

采用Illumina Miseq測序平臺得到樣本Z1、Z2、Z3、AA1對應的原始序列分別為80 569條、48 223條、48 878條和52178條，其平均長度分別為466.53bp、466.37bp、464.75bp和468.62 bp。經拼接、過濾，分別得到有效序列78 261條、46586條、47109條和50473條，其平均長度分別為426.63bp、427.06 bp、425.95 bp和429.46 bp。

2.2 序列豐富度和多樣性分析

基于高通量測序技術對濃香型白酒和芝麻香型白酒酒曲中細菌的測定序列數、操作分類單元（operationaltaxonomic units，OTU）和Alpha多樣性指數研究結果見表1。

Shannon指數、ACE指數、Chaol指數和Simpson指數是常用于描述微生物群落物種多樣性的Alpha多樣性指數，這4個多樣性指數可以對群落物種組成的豐富度及群落物種組成的均勻度進行綜合性的評價，4個多樣性指數中的Shannon指數對微生物群落物種豐富度更為敏感。其中Shannon指數越大，群落物種的多樣性越高，而Chaol或ACE指數越大則表明群落物種豐富度越高，由Coverage指數可知本次實驗的取樣是否合理，若Coverage指數＞97%，則證明本次取樣是合理的。但Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低[12]。

表1 不同酒曲中細菌的序列數、OUT數及Alpha多樣性指數分析Table 1 Analysis of sequence number,operational taxonomic unit number and alpha diversity index of bacteria in differentJiuqu

由表1可知，盡管Z1、Z2、Z3、AA1樣品對應的Alpha多樣性指數在絕對數值上略有差異，但都可以看出測序數據量已足夠大，可以反映樣本中絕大多數的微生物信息。對3個濃香型白酒和1個芝麻香型酒曲樣本中的細菌進行測序，共獲得197 439條序列，聚類分析共產生2 574個OTU分類。通過對4個樣本的對比分析：Z3樣本的Shannon指數最大，為3.17，因而Z3樣本的細菌群落多樣性最高；而Z1樣本的Chao1指數和ACE指數最大，分別為1040.64、1174.37，表明Z1樣本的細菌群落物種的豐富度最大；4個樣本的Coverage指數均＞97%，說明試驗的取樣是合理的，測序結果能反映樣本的真實情況；而AA1樣本的Simpson指數最大，為0.51，則證明AA1樣本的群落多樣性最低。

2.3 香農指數曲線分析

基于高通量測序技術對濃香型白酒和芝麻香型白酒酒曲中細菌的香農指數進行分析，香農指數曲線如圖1所示。

香農指數曲線反映樣品中微生物多樣性的指數，它可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU[13-14]。

由圖1可知，隨著測序數量的增加，香農指數曲線趨向平坦，說明測序數據量漸進合理。隨著測定序列數目的增加，樣本Z1、Z2、Z3的Shannon指數值均高于2.5，說明Z1、Z2、Z3號樣品的物種多樣性和豐富度都較高；Z1樣本和Z2樣本的香農指數曲線幾乎在同一曲線上，這是由于兩樣本的Shannon指數（分別為3.00和3.02）幾乎是相同的，所以微生物群落物種的多樣性幾乎是一樣的。而AA1號樣品的Shannon指數值較低，說明AA1號樣品的物種多樣性較低。

圖1 不同酒曲的香農指數曲線Fig.1 Shannon index curves of differentJiuqu

2.4 屬水平各樣本中細菌的種類和相對豐度分析

基于高通量測序技術的濃香型白酒和芝麻香型白酒酒曲在屬的水平上分析細菌的種類和相對豐度，根據豐度將樣本中菌屬分為優勢菌屬（豐度≥1.0%）和次要菌屬（豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類于其他（others），其結果見圖2～5。

圖2 Z1酒曲樣本中細菌屬及相對豐度Fig.2 Genus and relative abundance of bacteria inJiuquZ1

由圖2可知，Z1酒曲樣本中相對豐度≥1.0%的優勢細菌屬有9個，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）占比最大，為31%；其次為葡萄球菌屬（Staphylococcus），所占比例為26%；其余依次為魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、泛菌屬（Pantoea）、片球菌屬（Pediococcus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）。

由圖3可知，Z2酒曲樣本中相對豐度≥1.0%的優勢細菌屬有9個，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）所占比例最大，為51%；其次為明串珠菌屬（Leuconostoc），所占比例為10%；其余依次為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspo-ra）、泛菌屬（Pantoea）、乳球菌屬（Lactococcus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）。

圖3 Z2酒曲樣本中細菌屬及相對豐度Fig.3 Genus and relative abundance of bacteria inJiuquZ2

圖4 Z3酒曲樣本中細菌屬及相對豐度Fig.4 Genus and relative abundance of bacterial inJiuquZ3

由圖4可知，Z3酒曲樣本中相對豐度≥1.0%的優勢細菌屬有8個，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）所占比例最大，為56%；其次為魏斯氏菌屬（Weissella），所占比例為12%；其余依次為片球菌屬（Pediococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和乳球菌屬（Lactococcus）。

圖5 AA1酒曲樣本中細菌屬及相對豐度Fig.5 Genus and relative abundance of bacterial inJiuquAA1

由圖5可知，AA1酒曲樣本中相對豐度≥1.0%的優勢菌屬比較少，主要是芽孢桿菌屬（Bacillus）和別樣芽胞桿菌屬（Allobacillus），所占比例分別為91%和2%。別樣芽胞桿菌屬（Allobacillus）是一類革蘭氏陽性菌，需氧菌，球形孢子位于末端，具膨脹的孢子囊。氫氧化鉀試驗和L-丙氨酸氨基肽酶均為陰性。模式種是Allobacillushalotolerans[15]。這個屬是近年才確立的，2011年臺灣學者SHEU S Y等[15]在蝦醬里首次發現Allobacillus halotoleransgen.nov.，sp.nov.，本文首次在芝麻香型高溫酒曲里發現該屬。

對不同月齡的濃香型白酒酒曲中的細菌菌屬種類和相對豐度進行比對分析，結果見表2。

表2 濃香型白酒不同月齡酒曲中細菌菌屬及相對豐度Table 2 Genus and relative abundance of bacterial in theJiuquwith different ages

由表2可知，隨著濃香型白酒酒曲貯存時間的延長，乳桿菌屬（Lactobacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、片球菌屬（Pediococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）的相對豐度逐漸增加，而葡萄球菌屬（Staphylococcus）、泛菌屬（Pantoea）、芽孢桿菌屬（Bacillus）隨貯存時間的延長菌屬相對豐度越低。除此之外，明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度是先上升再下降，說明這兩類菌屬在貯存4個月過程會出現峰值，然后開始下降；魏斯氏菌屬（Weissella）則是先下降再上升。

3 結論

本研究基于Illumina MiSeq高通量測序研究了宋河酒業濃香型白酒中高溫酒曲和芝麻香型白酒高溫酒曲中的細菌群落結構。在屬的分類水平上分析，濃香型白酒中高溫酒曲的優勢類群（豐度≥1%）有9個，主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pedio-coccus）等。芝麻香型白酒高溫酒曲的優勢類群（豐度≥1%）主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）和別樣芽胞桿菌屬（Allobacillus），豐度分別為91%、2%，其中別樣芽胞桿菌屬（Allobacillus）是首次在酒曲中發現的細菌屬，且豐度較高，其特性和功能尚不清晰，有待更加深入地研究。采用高通量測序技術對酒曲中的菌落物種分類研究，操作簡單、通量高、信息豐富，和傳統方法比較具有一定的優越性。該研究成果為進一步研究優化制曲工藝、提高酒曲質量指明了方向，具有重要的理論和實踐意義。