甘肅部分酒類產品中氨基甲酸乙酯污染狀況調查

王慧娟，孫建云，馬文杰*

（甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730020）

酒精飲料（葡萄酒、白酒、黃酒等）作為傳統發酵工業中的一個重要分支，在為人類提供大量消費產品的同時也存在著一些潛在的危險因素，其中伴隨發酵過程而產生的氨基甲酸乙酯正越來越多的引起人們的注意[1]。氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一種發酵過程產生的天然副產物，是一種水溶性致癌物質，可引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等[2]。2007年國際癌癥研究機構對氨基甲酸乙酯（EC）進行了評估，將其修訂為2A類致癌物，即為可能的人類致癌物。隨著我國人均收入水平的提高和生活方式的改變，我國居民酒精飲料消費量日趨上升，EC對人體健康風險問題應該引起我國公共衛生的關注[3]。北美法規規定了不同飲料中所含氨基甲酸乙酯的數量及水平，世界各國逐漸重視了對其的研究工作。加拿大1985年設定了各類酒中的限量標準，其中佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超過30 μg/L，美國食品和藥品管理局（food and drug administration，FDA）規定1988年以后生產的佐餐葡萄酒（酒精度≤14%vol）中氨基甲酸乙酯含量≤15 μg/L，日本清酒規定其含量≤100 μg/L，由于受到多方面限制，我國含酒精飲料中（包括黃酒、葡萄酒、白酒、啤酒）均尚未制定氨基甲酸乙酯限量標準[4-8]。目前，酒精飲料中氨基甲酸乙酯的檢測主要有氣相色譜質譜（gas chromatography，GC）法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）熒光檢測器法[9]。樣品的前處理方法有液液萃取、固液萃取、固相萃取和固相微萃取[10-11]。本研究旨在通過對2010年到2013年采集部分酒類產品中氨基甲酸乙酯的氣質聯用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）監測結果進行分析，對我省的酒類產品中氨基甲酸乙酯的本底污染狀況有了一個初步的的調查和了解，為廣大人民群眾健康飲酒提供指導數據，為風險評估和相關標準的制定提供了基礎數據，對于尋求如何科學有效的降低酒中氨基甲酸乙酯的潛在含量的控制措施，提升品質，加強我省酒類產業的發展和升級提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒（37份）、白酒（65份）、葡萄酒（50份）樣品，共計152份：甘肅省14個地、州、市市售。

無水硫酸鈉：國藥集團化學試劑公司；乙酸乙酯、乙醚、甲醇等（均為色譜純）：美國默克公司；氨基甲酸乙酯標準品和內標（D5-氨基甲酸乙酯）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜質譜聯用儀、CLE-硅藻土固相萃相柱：美國Agilent公司；MX-F旋渦混合器：美國SCILOGEX公司；N-EVAP氮吹儀：美國Organomation公司；Visiprep SPE固相萃取儀：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取2.0 g樣品，加100 μL D5-氨基甲酸乙酯內標使用液，于旋渦混勻器上混勻，置于硅藻土固相萃取柱上，抽真空，讓樣液慢慢滲入柱中，靜置約10 min，用10 mL 5%乙酸乙酯/乙醚洗脫并收集于10 mL離心管中，洗脫液于30℃用氮氣（N2）緩緩吹干，用1 mL甲醇溶解移至樣品瓶中供GC-MS分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為DB-INNOWAX彈性石英毛細管柱（30 m×0.25mm×0.25μm）；進樣口溫度200℃，載氣流速1.0mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL；柱溫程序：初溫50 ℃、保持1 min，然后以10℃/min升至200℃。

質譜條件：電子電離源（electronic ionization，EI）溫度230℃；電子能量70 eV；接口溫度220℃；采用選擇離子監測（selected ion monitoring，SIM）模式；溶劑延遲：4 min。氨基甲酸乙酯特征離子：44、62、89，定量離子62：D5-氨基甲酸乙酯特征離子：44、64、76，定量離子64，內標法定量。

1.3.3 氨基甲酸乙酯標準曲線的繪制

準確移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL0.2μg/mL的氨基甲酸乙酯標準儲備液，加100 μL 1.0 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯溶液，用甲醇定容至1.0 mL，得到質量濃度分別為20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、120 ng/mL、160 ng/mL的標準使用液（含100.0 ng/mL D5-氨基甲酸乙酯），進行儀器分析，繪制氨基甲酸乙酯標準曲線。

1.3.4 方法的加標回收率及精密度試驗

稱取2.0 g樣品（可溶性固形物含量為30%～40%），分別添加50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL三個濃度水平的氨基甲酸乙酯標準溶液，以加標回收率試驗來驗證方法的可靠性；每個水平至少測定6組樣品，以相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來驗證方法的精密度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

EC、D5-EC標準品總離子流色譜圖見圖1。

圖1 EC、D5-EC標準品總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of EC and D5-EC standards

由圖1可知，氨基甲酸乙酯（EC）的出峰時間為13.16min，D5-氨基甲酸乙酯（D5-EC）的出峰時間為13.09min。

按照1.3.3的方法，配制標準曲線，以氨基甲酸乙酯與內標D5-氨基甲酸乙酯濃度比（X）為橫坐標，相對應的峰面積比（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果如圖2所示。

圖2 氨基甲酸乙酯標準曲線Fig.2 Standard curve of ethyl carbamate

由圖2可知，EC標準品在20～160 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數R2=1；標準曲線回歸方程為Y=0.479X+0.040 8。

2.2 方法的加標回收率及精密度試驗結果

按照1.3.4的方法進行了加標回收率試驗和精密度試驗，每個濃度水平進行6次平行測定，結果如表1所示。

表1 氨基甲酸乙酯加標回收率及精密度試驗結果（n=6）Table 1 Results of adding standard recovery rate and precision degree of ethyl carbamate(n=6)

由表1可知，氨基甲酸乙酯在3水平上添加回收率范圍為81.5%～93.0%，平均回收率為84.55%～90.93%，符合色譜分析回收率80%～120%的要求，說明方法適用。3個水平測定結果的RSD為1.94%～2.84%，均＜3%，說明方法的精密度良好，能保證測定結果的準確性和可靠性。當試樣取2.0 g時，以信噪比（S/N）為3時對應的含量作為方法的檢出限（limit of detection，LOD），將標準溶液稀釋進樣，得到本方法氨基甲酸乙酯含量的檢出限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

2.3 樣品檢出情況

按照1.3.1的方法對所有樣品進行了分析測定，不同酒類氨基甲酸乙酯檢出情況見表2，氨基甲酸乙酯檢出樣品的污染水平見表3。

表2 不同酒類氨基甲酸乙酯檢出情況Table 2 Detection of ethyl carbamate in different alcoholic drinks

表3 不同酒類氨基甲酸乙酯檢出樣品中污染水平Table 3 Contamination levels of ethyl carbamate in different alcoholic drinks

由表2、表3可知，所有樣本的總體檢出率為70%，其中黃酒37份，檢出28份，檢出率為75%，污染水平為2.99～77.59 μg/kg；白酒65份，檢出30份，檢出率46%，污染水平為8.31～203.39 μg/kg；葡萄酒50份，檢出49份，檢出率為98%，污染水平為1.92～25.81 μg/kg。三種酒類中白酒的檢出率最低，樣本檢出數據跨度最大，而且單個樣本的最高值出現在白酒中，為203.39μg/kg；葡萄酒的檢出率最高，但樣本檢測數據的跨度最小，單個樣本的最小值也出現在葡萄酒中，為1.92 μg/kg。

2.4 甘肅省酒類產品中氨基甲酸乙酯與全國水平對比

全國食品污染物監測網新增酒類中EC監測結果與甘肅省酒類樣品中氨基甲酸乙酯污染水平比較見圖3。

通過圖3對比發現，全國三種酒類EC的污染水平的狀況為黃酒最高（116μg/kg），白酒居中（50.0μg/kg），葡萄酒最低（20.5μg/kg）；甘肅省的平均數據為白酒最高（34.93μg/kg），黃酒居中（20.24 μg/kg），葡萄酒最低（9.88 μg/kg）。甘肅省的污染水平與全國的污染水平存在一定差異，主要表現為黃酒和葡萄酒的平均水平偏低，白酒的檢出率偏低。通過深入分析和總結，核對樣本信息后發現，造成差異的原因可能是：黃酒在甘肅省的酒類消費比例中所占比重較小，品牌也比較單一，所采集到的樣品多為含黃酒的料酒等；葡萄酒存在同樣的情況，樣本中甜型或半甜型葡萄酒所占比重較大，干紅等發酵酒所占比例較低，所以整體數值偏低；白酒樣本的品質較低，對部分樣本走訪調查發現整體價格不高，推斷其中的勾兌酒可能較多，因此檢出率偏低，從白酒的樣本信息還發現所檢測的白酒中氨基甲酸乙酯含量，酒精度越高，儲存時間越長的白酒，氨基甲酸乙酯的含量也越高。本研究是依托國家化學污染物監測網展開的，采樣方式是委托市級兄弟單位進行采樣，由于在樣品采集過程中，只對樣品采集地類型和采樣方式進行了規定，沒有對樣品的類型進行細致規定，使得研究結果與全國水平存在差異，只能代表甘肅部分酒類產品中氨基甲酸乙酯的污染狀況。

圖3 甘肅省與全國酒類氨基甲酸乙酯污染水平對比Fig.3 Comparison of contamination levels of ethyl carbamate in Gansu province and China

3 結論

用固相萃取結合氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法對酒類產品中的氨基甲酸乙酯進行檢測，該方法的加標回收率為84.55%～90.93%，相對標準偏差（RSD）＜3%，方法的精密度和準確度良好。對甘肅省152份酒類樣品樣品的測定結果顯示，EC檢出率為70%，其中白酒最高，其次為黃酒，葡萄酒最低，含量分別為34.93μg/kg、20.24μg/kg、9.88μg/kg。甘肅地處西北，經濟發展水平相對落后，消費水平偏低，下一步結合膳食結構的調查可以對該類污染物進行有效的預測、預警及風險性評估，為更加全面的分析甘肅省酒類產品中氨基甲酸乙酯污染水平提供了基礎和思路。同時研究結果對于我國酒精飲料中EC的限量標準的制定提供一定的基礎數據，對于我國生產的酒精飲料的競爭性及安全性[12-15]具有積極的意義。