β-甘露聚糖酶產生菌的篩選及魔芋低聚糖制備工藝的研究

郭金玲，張丹陽，樊雪蓮，呂育財，田毅紅，龔大春

（1.三峽大學 湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學 生物催化宜昌市重點實驗室，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌 443002）

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是多年生經濟作物魔芋（Amorophophallus konjac）的主要活性成分，由D-甘露糖和D-葡萄糖通過β-1,4-D-糖苷鍵按1.6∶1的物質的量比例連接而成，在甘露糖和葡萄糖殘基的C3位置存在分支[1]。KGM為水溶性膳食纖維，有輔助醫療和保健作用，是一種優良的食品添加劑[2]。然而，由于其分子量大（可達105～106）[3]，具有遇水后高膨脹、高黏度的特性，過量攝入將引起抗營養作用，從而使其應用受到限制。KGM水解產物魔芋低聚糖不僅水溶性高，還具有改善腸道內菌群結構、增強機體免疫力、抑制病原菌生長、降低血清總膽固醇及甘油三酯水平和減少有毒代謝產物產生等重要生理功能，成為新一代功能性食品[4]。因此，對KGM的水解改性研究成為國內外的研究熱點。

β-甘露聚糖酶是一類可以水解β-1,4-D-甘露糖苷鍵的內切型水解酶，能夠將KGM水解為由2～10個單糖分子連接而成的魔芋低聚糖，細菌、酵母菌、霉菌和放線菌均有產β-甘露聚糖酶的能力[4-5]。目前，細菌中的芽孢桿菌屬（Bacillus）和霉菌中的曲霉屬（Aspergillus）成為已報道的β-甘露聚糖酶的主要來源，研究主要集中在新的產酶微生物的發現、新酶的結構表征、酶的表達與改造等方面[6-11]。雖然β-甘露聚糖酶來源廣泛、數量眾多，但由于KGM溶于水后分子鏈伸展，黏度非常大，在β-甘露聚糖酶催化其水解的過程中，KGM濃度仍然比較低，導致了酶解產物后處理成本高、生產效率低[12]。因此，進一步開發能夠在高底物濃度下快速水解KGM制備魔芋低聚糖的β-甘露聚糖酶具有重要意義。

本研究以魔芋粉為唯一碳源，從土壤中定向篩選可高效降解KGM為魔芋低聚糖的微生物，并對產酶微生物進行鑒定，研究其水解KGM的工藝條件，為實現魔芋低聚糖的高效制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

土壤樣品：采自湖北省宜昌市長陽縣魔芋種植地土壤。

1.1.2 試劑

魔芋膠（KGM含量≥95%）：湖北一致魔芋生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（純度＞98%）：上海源聚生物科技有限公司；薄層硅膠板G型（50 mm×100 mm）：青島海浪硅膠干燥劑有限公司；甘露糖（純度98%）：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養基

初篩培養基：魔芋粉3.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgCl20.2 g/L，KH2PO41.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養基：魔芋粉10.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：同種子培養基，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

AR2140型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；鐳磁PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SX-700蒸汽滅菌器：日本Tomy公司；SW-CT-1D型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；ZQLY-180型振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；MX-307落地高速冷凍離心機：日本Tomy公司；UV1800紫外可見分光光度計：日本島津公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 產β-甘露聚糖酶微生物的篩選

（1）初篩：稱取5.0 g土樣加入45 mL無菌水中，搖床振蕩20 min，使土壤中微生物充分混于水中，靜置15 min。取1 mL上清液于無菌具塞試管中，加入9 mL無菌水，搖勻后依次梯度稀釋至10-5。分別吸取10-3、10-4和10-5三個稀釋度的菌懸液0.2 mL涂布于初篩培養基上，放入30℃恒溫培養箱中倒置培養24 h，0.1%剛果紅溶液染色10 min后觀察水解圈大小，挑取水解圈與菌落直徑之比較大的菌株純化后置于4℃冰箱保存。

（2）復篩：將初篩得到的菌株接種于50 mL種子培養基中，30℃、200 r/min培養24 h后按1%（V/V）接種量接種至50 mL發酵培養基中，于相同條件下搖瓶培養48 h，發酵液經5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。分別測定各菌株的β-甘露聚糖酶活力，篩選出β-甘露聚糖酶活力最高的出發菌株。

1.3.2 菌種G1的鑒定

（1）形態學及生理生化鑒定

參照文獻[13-14]測定菌株G1的革蘭氏染色、甲基紅試驗、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、尿素利用、明膠水解、淀粉水解、生長pH范圍、耐受鹽濃度和糖發酵試驗等生理生化指標。

（2）分子生物學鑒定

分子生物學鑒定由上海生物工程有限公司完成，序列在美國國立生物技術信息中心（nationalcenterforbiotechnology information，NCBI）網站上進行Blast搜索，選取同源性較高菌株的16S rDNA序列進行比對，利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.3 魔芋低聚糖制備工藝條件的優化

魔芋低聚糖的制備工藝：用pH為4.5～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制不同質量分數的KGM底物溶液，加入不同添加量（酶添加量用酶活力（U）與底物含量（g）來表示，U/g KGM）的β-甘露聚糖酶，于不同的恒溫水浴鍋中酶解。

制備工藝條件優化單因素試驗：以還原糖轉化率為評價指標，采用單因素輪換法考察酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）、酶解pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、酶添加量（2 U/g、5 U/g、10 U/g、20 U/g、30 U/g、40 U/g、50 U/g、60 U/g、70 U/g、80 U/g）、底物濃度（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）以及不同底物質量濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L）條件下酶解時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7h、8 h、9 h和10 h）對魔芋低聚糖制備的影響，初始條件為pH 6.5，底物濃度10 g/L，酶添加量50 U/g，酶解時間2 h。

1.3.4 檢測方法

（1）β-甘露聚糖酶活力的測定

甘露糖標準曲線的繪制：配制0.2 g/L甘露糖標準溶液，取6支10 mL刻度試管，分別加入甘露糖標準溶液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL，蒸餾水2.5mL、2.0mL、1.5 mL、1.0mL、0.5mL、0，混勻后加入DNS2.5mL，于沸水浴中煮沸7min后迅速冷卻，加入蒸餾水補足至10mL，以空白組調零，于波長540 nm條件下測定吸光度值，以甘露糖含量為橫坐標，以吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程如下：

y=1.738x-0.141 8（R2=0.999 1）。

β-甘露聚糖酶活力的測定：參照文獻[15]，取A、B兩支刻度試管，分別向其中加入2.4 mL、pH 5.5 KGM（5.0 g/L）溶液，于50℃水浴鍋中預熱5 min，在A管中加入0.1 mL經過適當稀釋的粗酶液，B管不加酶液。50℃水浴條件下準確反應10min，立即分別向試管A和B中加入2.5mLDNS試劑，終止反應。再向B管中補加0.1 mL上述酶液，沸水中煮沸反應7 min，待冷卻后向各管加入去離子水5 mL，搖勻，以B管為空白對照，于波長540nm處測量A管吸光度值（A540nm）。依據甘露糖標準曲線計算出溶液中生成的還原糖量（mg），再計算得到酶活。β-甘露聚糖酶酶活力定義：在上述條件下，每1 min產生1 μmol還原糖（以甘露糖為準）的酶量定義為1個甘露聚糖酶活力單位（U）。

（2）還原糖轉化率的測定

樣品還原糖轉化率的測定：分別取適當稀釋的酶解樣品及空白（KGM底物溶液）于10 mL刻度試管中，按甘露糖標準曲線繪制的方法測定酶解樣品液的吸光度值，每組實驗做3次重復，由甘露糖標準曲線計算還原糖的量，并計算還原糖轉化率，其計算公式如下：

（3）酶解產物的定性檢測

采用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法根據各物質的比移值對酶解產物進行定性檢測。將KGM（10 g/L）溶液及在最佳工藝條件下酶解1 h和2 h的KGM（10g/L）酶解液于沸水浴中煮沸5min，8000r/min離心10min后的上清液分別點樣到G型硅膠板（50 mm×100 mm）上，標準品為甘露糖和甘露三糖。點樣后置于正丁醇∶冰乙酸∶水的體積比為12∶6∶6的展層劑中展層，展層結束后，將硅膠板取出吹干，用噴霧器均勻淋噴苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑，于100℃烘箱顯色15 min[16-17]。

2 結果與分析

2.1 產β-甘露聚糖酶微生物的篩選與鑒定

2.1.1 產β-甘露聚糖酶微生物的篩選

圖1 菌株G1在初篩培養基平板上對魔芋葡甘聚糖的降解效果Fig.1 The degradation effect of strain G1 on konjac glucomannan on the primary screening medium plate

采用以魔芋粉為唯一碳源的培養基，經剛果紅染色初篩和發酵復篩，從湖北省宜昌市魔芋地土壤中分離出一株水解圈與菌落直徑之比較大（比值為2.3）、酶活性較高（70.1U/mL）的菌株，編號為G1，其在初篩培養基上對KGM的降解效果如圖1所示。

2.1.2 菌株G1的鑒定

菌株G1的形態觀察、生理生化試驗結果見表1，系統發育樹如圖2所示。

表1 菌株G1的生理生化性質Table 1 Physiological and biochemical characterizations of strain G1

圖2 基于16S rDNA序列分析的菌株G1的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain G1 based on 16S rDNA sequence analysis

由表1可知，菌株G1呈革蘭氏陽性，具有不能利用尿素，可水解淀粉和明膠，能耐受90 g/L鹽濃度等性質。由圖2可知，該菌株G1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，同源性＞99%，結合形態觀察和生理生化試驗結果，鑒定菌株G1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.2 魔芋低聚糖制備工藝條件優化

2.2.1 酶解溫度對魔芋低聚糖制備的影響

酶解溫度對魔芋低聚糖制備的影響結果如圖3所示。由圖3可知，在溫度為40～55℃之間時，還原糖轉化率隨溫度的升高呈上升趨勢；溫度為55℃時，還原糖轉化率達到最高值（51.2%）；在55℃之后，還原糖的轉化率隨著溫度的升高明顯下降，分析原因可能是由于高溫引起酶活力損失，導致酶解能力下降[17]。因此，確定55℃為最佳酶解溫度。此結果與SRIVASTAVA P K等[5]報道的Bacillus屬β-甘露聚糖酶的最適溫度相符。

圖3 酶解溫度對還原糖轉化率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the conversion ratio of reducing sugar

2.2.2 酶解pH值對魔芋低聚糖制備的影響

不同酶解pH值對魔芋低聚糖制備影響的結果見圖4。

圖4 酶解pH值對還原糖轉化率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH value on the conversion ratio of reducing sugar

由圖4可知，當酶解pH值為4.5～6.5時，還原糖轉化率隨pH值的增大而增加；pH值為6.5時，還原糖轉化率達到最高（51.3%）；當pH值＞6.5之后，還原糖轉化率隨pH值的增大而降低；當pH為8.0時，還原糖轉化率仍然可達到42.4%。通常，隨著酶解pH值偏離最適pH值酶解效率會明顯下降[17-18]。本研究中的β-甘露聚糖酶在pH 4.5～8.0范圍內均具有較好的轉化效果，說明對pH具有較強的耐受性。最終確定KGM酶解的最適pH值為6.5，與何丹等[18]報道的酶法制備魔芋甘露寡糖的最適pH值一致。

2.2.3 酶添加量對魔芋低聚糖制備的影響

β-甘露聚糖酶添加量對魔芋低聚糖制備的影響結果見圖5。由圖5可知，酶添加量為2～50 U/g時，隨著β-甘露聚糖酶添加量的增加，還原糖的轉化率迅速增加，由9.0%增加至51.5%；當加酶量達到50 U/g以后，還原糖的轉化率的增加緩慢，且與50 U/g的加酶量時還原糖的轉化率差異不顯著（P＞0.05）。考慮到使用成本，選擇50 U/g為最佳酶添加量。目前，已報道的工藝中酶添加量大多在50～250 U/g，本研究與其處于同一水平[12，15，17-18]。

圖5 酶添加量對還原糖轉化率的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on the conversion ratio of reducing sugar

2.2.4 底物質量濃度對魔芋低聚糖制備的影響

底物質量濃度對魔芋低聚糖制備的影響結果如圖6所示。

圖6 魔芋葡甘聚糖濃度對還原糖轉化率的影響Fig.6 Effect of konjac glucomannan concentration on the conversion ratio of reducing sugar

由圖6可知，在GM質量濃度為5～10 g/L時，還原糖轉化率增加不顯著（P＞0.05）；還原糖的轉化率在KGM質量濃度為10 g/L時達到最大（51.6%）；繼續增加KGM濃度時，還原糖的轉化率隨之降低，當KGM質量濃度為30g/L時，還原糖轉化率下降至35.9%。這主要是由于魔芋膠吸水性強，隨著底物濃度的增大，黏度迅速增加，嚴重阻礙酶對底物的充分水解，同時也限制了可溶性還原糖的釋放，因此，還原糖轉化率下降[15]。然而，本實驗中篩選的β-甘露聚糖酶對30 g/L的KGM底物仍具有較好的轉化效果（35.9%），酶解2 h后還原糖轉化率可以達到30%以上，表明來源于B.subtilisG1的β-甘露聚糖酶具有較好的應用前景。

2.2.5 酶解時間對魔芋低聚糖制備的影響

為了加強高底物濃度下的酶解效果，考察了酶解時間對魔芋低聚糖制備的影響。不同底物濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L）條件下，酶解時間對魔芋低聚糖制備的影響結果如圖7所示。

由圖7可知，當底物質量濃度為10 g/L時，酶解2 h時還原糖轉化率達到51.6%，之后還原糖的轉化率趨于穩定，穩定在50.1%～54.5%范圍內；當底物質量濃度為20 g/L時，酶解時間為0～4 h時，隨著酶解時間的延長，還原糖轉化率迅速增加，在4 h時還原糖轉化率達到49.5%，4～10 h時增加速率減慢，由49.5%增加至56.2%；當底物質量濃度為30 g/L時，酶解時間為0～4 h時，還原糖轉化率隨著酶解時間的延長而迅速增加，酶解4h時，還原糖轉化率達到46.9%，之后趨于緩慢增加，由46.9%增加至53.6%。

圖7 酶解時間對還原糖轉化率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis time on the conversion ratio of reducing sugar

由此得出魔芋低聚糖制備的最佳工藝條件為：溫度55℃，pH 6.5，酶添加量50 U/g，KGM質量濃度10 g/L時，酶解時間為2h，KGM質量濃度為20～30g/L，酶解時間為4h。

2.3 酶解產物的定性檢測

酶解產物的定性檢測結果如圖8所示。

圖8 魔芋葡甘聚糖酶解產物的薄層層析分析Fig.8 Thin layer chromatography of enzymolysis products of konjac glucomannan

由圖8可知，隨著酶解時間的延長，點樣處的顏色逐漸變淺，KGM質量濃度為10 g/L，酶解1 h和2 h后的酶解產物主要為三糖及三糖以上的低聚糖。

3 結論

本研究從魔芋地土壤中定向篩選出了一株高產β-甘露聚糖酶的菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtili）G1。該酶水解魔芋膠制備魔芋低聚糖的工藝條件為：酶添加量50 U/g，酶解pH6.5，酶解溫度55℃；KGM質量濃度為10g/L時，酶解時間為2 h，還原糖轉化率為51.6%；KGM質量濃度為30 g/L時，酶解時間4 h，還原糖轉化率仍可達到46.9%，表明該酶具有較高的催化效率。通過薄層層析定性檢測，發現酶解產物主要為三糖及三糖以上的低聚糖。本研究中獲得的β-甘露聚糖酶在制備魔芋低聚糖上表現出優良的性能，為實現酶法制備魔芋低聚糖的工業化生產奠定了基礎。