酵母種類及營養劑用量對霞多麗葡萄酒中氨基甲酸乙酯產量的影響

王根杰，李德美*，張亞東，辛 聞，王宗義

（北京農學院 食品科學與工程學院，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）天然存在于大多數發酵食品如面包、牛奶等和酒精飲料（啤酒、白酒、葡萄酒等）中[1]。

早在20世紀70年代，有學者發現EC具有潛在的致癌作用[2]。在葡萄酒釀造過程中，酵母代謝精氨酸產生尿素，當尿素產量過高時，會從酵母細胞內釋放到葡萄汁中，與發酵產生的乙醇結合生成EC，這也是產生EC的主要途徑。在酒精發酵過程中，酵母優先利用的氮源為銨態氮、游離α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽，統稱為酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN）[3]。而葡萄汁中的YAN含量主要與土壤中的銨態氮含量有關[4]。

近年來，隨著我國國民生活水平的不斷提高，葡萄酒的消費量也日益增長。據有關研究報道，我國預計在2020年將成為世界第二大葡萄酒消費國[5]。然而，我國目前還沒有規定葡萄酒中的EC限量標準，葡萄酒質量安全仍然存在很大的隱患。

目前國內對于葡萄酒中EC的研究主要多為尿素、精氨酸、瓜氨酸等對葡萄酒中EC含量的影響，以及發酵溫度、貯存溫度、乳酸菌等對葡萄酒中EC含量的影響[6-8]。本試驗的葡萄園地屬延懷河谷，土壤較為貧瘠，土壤缺氮較為嚴重[9]。因此在葡萄酒發酵過程中需要補充一定的氮源保證發酵順利進行。然而，酵母營養劑的用量對EC產量的影響，且EC產量的變化規律及不同酵母對EC產量的影響研究也相對較少。因此，本試驗采用穩定同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法測定葡萄酒中的EC含量，研究了葡萄酒釀造過程中不同酵母和不同酵母營養劑用量對葡萄酒中EC產量的影響，同時闡明葡萄酒中EC的含量與葡萄園土壤和葡萄汁中的氮含量之間的關系，為實際生產提供參考，同時為我國制定葡萄酒中EC限量標準提供基礎支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄原料霞多麗（Chardonnay）、葡萄園土壤樣品：河北懷來紅葉酒莊；商業釀酒酵母（Saccharomyces cere visiae）X5、X16、RMS2、酵母營養劑（THIAZOTE）：法國Laffort公司；銨離子氮試劑盒（96 Assays per kit）、氨基酸態氮試劑盒（100 Assays per kit）：愛爾蘭Megazyme International Ireland有限公司。

氯化鉀、硝酸鉀、氫氧化鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、次氯酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銨（均為分析純）：北京藍弋試劑公司；甲醇、冰醋酸（色譜級）：美國Mreda公司；乙腈（色譜級）：韓國SK chemicals公司；氨基甲酸乙酯（EC）標準品、氨基甲酸乙酯內標化合物（EC-d5）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV9100雙波長紫外分光光度計：北京Lab-Tech公司；6410 Triple Quad液相色譜-串聯質譜儀（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）（配化學工作站軟件B.02.01版）：美國Agilent公司；HealForceRSuperSeries NW超純水系統：上海Canrex分析儀器有限公司；MS3基本型渦旋混合器：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

本研究以河北懷來紅葉酒莊2016年霞多麗葡萄為實驗材料。采收當天，根據標準對葡萄園的1-1、1-2和1-3三個葡萄地塊進行土樣的采集、處理和貯存，測定土壤中的銨態氮含量。葡萄采樣結束后，盡快送到實驗室進行壓榨與澄清處理，同時取葡萄汁（含糖量265 g/L、酸度（酒石酸計）為8.68g/L、pH值為3.20、葡萄汁初始密度為1.098）樣品，貯存于-20℃低溫冰箱待測。

1.3.2 霞多麗葡萄酒的發酵工藝及操作要點

按照干白葡萄酒發酵工藝進行，不進行蘋-乳發酵，霞多麗葡萄酒工藝流程如下：

操作要點：

（1）葡萄酒在除梗破碎過程中添加SO2（30 mg/L偏亞硫酸鉀），減少原料的氧化。

（2）葡萄原料經過壓榨后，在10℃以下低溫澄清24 h。

（3）酵母菌接種量為0.2g/L，溫度范圍控制在15～20℃，在酒精度、還原糖含量基本不變時終止發酵。

（4）發酵期間溫度范圍控制在15～20℃。發酵前期、中期階段，每12 h監測溫度、密度；發酵末期階段，每8 h監測溫度、密度。

1.3.3 方案設計

酵母種類的影響：選用生產常用的商業酵母X5、X16、RMS2研究發酵過程中不同酵母對EC產量的影響。根據酒莊實際生產，酵母菌接種量和酵母營養劑THIAZOTE添加量均為0.2 g/L。酵母接種前需要在37℃左右水溫中活化20～30 min。

酵母營養劑用量的影響：本試驗以酵母X16（酒莊發酵霞多麗葡萄酒的酵母）接種量為0.2 g/L進行酵母營養劑不同用量對葡萄酒中EC產量影響的研究，酵母營養劑用量為0、0.3g/L、0.6g/L，以下分別記為YNCK、YN0.3和YN0.6。

上述6個處理均設置3次重復，共18個發酵單元。分別在發酵初期階段（密度為1.090）、中期（密度為1.040）和末期階段（密度為1.010）取樣測定葡萄酒中的EC產量。

1.3.4 指標測定與方法

（1）土壤中銨態氮含量的測定[10]

土壤中銨態氮（NH4+-N）含量的測定采用氯化鉀（KCl）浸提-靛藍比色法，其計算公式如下：

式中：C為顯色液銨態氮的含量，μg/kg；V為顯色液體積，mL；ts為分取倍數；m為土樣的質量，g。

（2）葡萄汁中酵母可同化氮的測定[11]

采用試劑盒檢測氨基酸態氮和銨離子氮含量，計算公式如下：

ΔA=（A1-A2）樣-（A1-A2）空白

式中：X1為氨基酸態氮含量，mg/L；V為終體積，mL；MW為氮摩爾質量，g/mol；ε為氮素在波長340 nm處的消光系數；d為光路距離，cm；v為樣品體積，mL。

ΔA=（A1-A2）樣-（A1-A2）空白

式中：X2為銨離子氮含量，mg/L；V為終體積，mL；MW為氮摩爾質量，g/mol；ε為氮素在波長340 nm處的消光系數；d為光路距離，cm；v為樣品體積，mL。

可同化氮含量（mg/L）=X1+X2

（3）葡萄酒理化指標的測定[12]

根據國標GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用試驗方法》中的直接碘量法測定葡萄酒中游離SO2和總SO2的含量。

（4）葡萄汁或葡萄酒中EC含量的測定

采用穩定同位素稀釋-高效液相色譜-串聯質譜法[13]測定葡萄汁及葡萄酒中EC含量。

樣品前處理：將酒樣搖勻，立即準確取出1.00 mL于5 mL試管中，準確加入25 μL 10 μg/mL的EC-d5內標工作液，旋渦振蕩5 s，吸取樣液過0.22 μm濾膜，待分析。

高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）條件：XSELECT HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），Zorbax Eclipse Plus-C18預柱（12.5 mm×2.1 mm，5μm）。柱溫為40℃，進樣體積為10μL，流速為0.3mL/min；流動相A為0.1%（V/V）乙酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫順序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Procedures of gradient elution

質譜條件：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子模式，多反應離子監測（multiple reaction monitoring，MRM）方式監測，MRM參數見表2。干燥氮氣溫度為120℃，流速為10L/min；霧化器壓力20psi；噴霧毛細管電壓4000V。

表2 MRM參數Table 2 Parameters of multiple reaction monitoring

1.3.5 數據統計分析

數據處理與分析采用SPSS22.0，對葡萄酒中的理化指標進行多重比較分析，酒精發酵過程中的溫度密度變化趨勢圖和EC產量圖分別用Origin 9.0和Excel繪制。

2 結果與分析

2.1 葡萄園土壤和葡萄汁中的氮含量與葡萄酒中的EC含量關系

葡萄酒發酵過程中酵母代謝精氨酸產生的尿素與乙醇結合是生成EC的主要途徑。由此可見，葡萄汁中的精氨酸是EC的主要前體物質之一。氨基酸是葡萄酒發酵所需的重要氮源，而YAN含量是衡量葡萄汁中氮源是否充足的重要指標。本試驗研究了土壤中和葡萄汁中的氮含量與葡萄酒中的EC含量關系，結果見表3。

表3 葡萄園土壤和葡萄汁中的含氮量、葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量Table 3 Nitrogen contents in soil and grape juice,and ethyl carbamate contents in wine

由表3可知，不同葡萄園地塊土壤中的銨態氮含量、葡萄汁中的YAN含量和葡萄酒中的EC含量均不同。土壤中的銨態氮含量越高，葡萄汁中的YAN含量越高，最終葡萄酒中的EC含量也相對越高。此外，可以看出葡萄酒中的EC含量均在5 μg/L以下，含量較低，這可能與最初土壤中的銨態氮含量較低有關。

2.2 葡萄酒中主要理化指標的含量

酒精發酵結束后，葡萄酒經自然澄清后，與酒泥分離，經過澄清、過濾、裝瓶，置于瓶儲室（溫度在15～20℃，相對濕度在65%～70%）貯存3個月后取樣。檢測葡萄酒中的理化指標含量，結果見表4。

表4 霞多麗葡萄酒中理化指標檢測結果Table 4 Detection results of physicochemical indexes of Chardonnay wine

由表4可知，葡萄酒指標含量均在正常范圍內，符合葡萄酒國標要求。說明葡萄酒發酵過程控制合理，葡萄酒狀態良好，滿足葡萄酒中EC含量測定對酒樣的要求。

2.3 發酵過程中酵母種類對葡萄酒中EC產量的影響

酵母是葡萄酒發酵過程中的重要因素，不僅會對葡萄酒的外觀、香氣和口感產生重大影響，同時也會產生大量微量的代謝產物[14]。隨著發酵的進行，酵母菌容易利用的谷氨酸、谷氨酰胺等小分子氮源越來越少，酵母菌開始代謝精氨酸、核苷酸等含氮化合物，其代謝產生的瓜氨酸、氨甲酰磷酸、尿素等分泌到酒體中，與已積累的乙醇反應生成EC[15]。

發酵過程中不同酵母對霞多麗葡萄酒中EC產量的影響見圖1。由圖1可知，所研究的3種酵母的EC產量存在一定的差異。在發酵過程中，3種酵母的EC產量均呈逐步增長的趨勢。在發酵初期階段，酵母X16、RMS2和X5釀造的霞多麗葡萄酒中均有少量EC產生。在發酵末期階段，3種酵母釀造的葡萄酒中EC產量均達到較大值。酵母X5、RMS2與X16相比，發酵末期階段釀造的葡萄酒中EC產量分別增長了53.8%和17.6%，說明葡萄酒中的EC產量與酵母的菌種特性和氮代謝能力有關，這與于英等[15]研究結果一致。

圖1 不同酵母種類在發酵過程中對葡萄酒中氨基甲酸乙酯產量的影響Fig.1 Effects of different yeast type on ethyl carbamate contents during wine fermentation process

2.4 不同酵母營養劑用量對葡萄酒中EC產量的影響

在酒精發酵過程中，酵母需要一定量的含氮化合物進行生長繁殖。否則，發酵會因氮源物質的缺乏而延緩甚至停滯[16]。酵母營養劑的成分主要是磷酸氫二銨，可以補充酵母所需氮源，加快發酵速率。而過量的磷酸氫二銨也會產生EC[17]。不同酵母營養劑用量對霞多麗葡萄酒中EC產量的影響結果見圖2。

圖2 不同酵母營養劑用量在發酵過程中對葡萄酒中氨基甲酸乙酯產量的影響Fig.2 Effects of different yeast nutrients addition on ethyl carbamate contents during wine fermentation process

由圖2可知，在發酵初期階段，添加酵母X16后，葡萄發酵液中未產生EC，可能與EC產量在檢測限以下有關，也說明發酵初期階段EC產量較低。在發酵中期階段添加酵母營養劑后，酵母營養劑不同用量處理釀造的葡萄酒中EC產量與發酵前期階段相比均有增長，且YN0.3、YN0.6均比對照組YNCK釀造的葡萄酒中的EC產量高。與發酵中期階段相比，YNCK、YN0.3、YN0.6在發酵末期階段的EC產量分別增長了73.3%、95.0%、76.0%，表明酵母營養劑的使用有提高EC產量的風險。而在發酵末期階段，酵母營養劑不同用量釀造的葡萄酒中的EC產量有一定的差異，與YNCK相比，YN0.3和YN0.6釀造的葡萄酒中的EC產量分別增加了12.8%、69.2%。結果顯示，隨酵母營養劑用量增加，釀造的葡萄酒中的EC產量增大。

2.5 葡萄酒中的EC含量

表5 不同處理葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量測定結果Table 5 Determination results of ethyl carbamate contents in wine with different treatments

由表5可知，不同發酵處理釀造的葡萄酒中的EC含量不同。酵母X5釀造的葡萄酒中的EC含量最高，X16釀造的葡萄酒中的EC含量最低。發酵末期階段，各發酵處理釀造的葡萄酒中的EC含量均有所下降。這與朱亞楠等[18]測定葡萄酒新酒中的EC含量較低的結果相一致，且含量水平均低于10 μg/L，符合美國或歐盟的EC含量限定標準[19]。

3 結論

不同酵母和酵母營養劑不同用量對霞多麗葡萄酒中EC產量影響的研究結果表明，發酵過程中，不同酵母種類釀造的葡萄酒中的EC產量不同，最終酵母X5、RMS2和X16釀造的葡萄酒中EC含量分別為3.8μg/L、3.0μg/L和2.1μg/L。在本試驗中，不同酵母釀造的葡萄酒中的EC產量之間無明顯差異。不同酵母營養劑用量對霞多麗葡萄酒中的EC產量影響的研究表明，發酵過程中，隨著酵母營養劑用量的增加，葡萄酒中的EC產量越大，說明酵母營養劑的添加有提高EC含量的風險。在發酵末期階段，與對照相比，酵母營養劑THIAZOTE添加量為0.3 g/L和0.6 g/L釀造的葡萄酒中EC產量分別增加了12.8%和69.2%。葡萄酒發酵過程中，在酵母X16接種量為0.2 g/L的條件下，不添加酵母營養劑釀造的葡萄酒中EC產量相對最低。但在實際生產中，酵母營養劑的添加量要根據葡萄發酵液中的酵母可同化氮含量確定。在實驗葡萄園現有的土壤氮素營養水平下，生產采用的酵母與酵母營養劑類型和用量，所釀造的葡萄酒EC產量范圍為2.1～3.8 μg/L，均未超過美國或歐盟限量水平。

在本試驗中，盡管采用不同酵母和不同酵母營養劑用量釀造的霞多麗葡萄酒中的EC產量之間差異較小，但是可以說明葡萄酒經過發酵后EC產量均處于較低水平。另一方面，本試驗說明葡萄園土壤中的銨態氮含量會最終影響葡萄酒中的EC含量，因此對于氮肥的合理施用有一定的指導意義。此外，葡萄酒的品質不僅僅是由發酵過程決定的，還包括橡木桶陳釀、調配工藝、貯藏溫度等因素。而這些因素也會對葡萄酒中EC含量產生影響，因此還需要結合起來進一步研究。