拮抗菌巨大芽孢桿菌L2發酵條件的響應面優化

吉玉玉，黃 慧，肖 洋，陳 雪，代園鳳，李 祝*，楊 龍，張 素，趙妗頤，唐婧紅，張欽語

（1.貴州省煙草公司 畢節市公司，貴州 畢節 551700；2.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省產品質量監督檢測院，貴州 貴陽 550016）

果蔬采后病原真菌的侵染是引起果實腐爛的重要原因之一[1-2]。據統計，由微生物侵染造成的采后果蔬腐爛占20%～25%[3]。鏈格孢菌（Alternaria alternata）屬于半知菌亞門鏈格孢屬，是番茄、甜瓜、梨、蘋果等眾多果蔬采后病害的主要病原菌[4-5]，會造成貯藏、運輸和銷售中的大量爛果，損失嚴重。目前，使用化學殺菌劑仍是現在世界各國控制采后果實病害的主要方法[6]。但是長期使用化學藥劑會導致病原菌產生抗藥性，還會因果蔬農藥殘留量增加而威脅著人類的身體健康[7]。因此，發展無公害型生物農藥來控制果蔬采后病害成為一種新趨勢，逐漸成為研究熱點[8-10]。在過去的20多年里，生物防治作為一種防治采后果實腐爛的有效方法而涌現出來[11-17]，此方法具有貯運條件易控制、處理目標明確、外界微生物干擾少、產品集中、處理費用低廉等特點和優點[18]。目前，應用較多的生防細菌主要有芽孢桿菌（Bacillusspp.）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）、假單胞桿菌（Pseudomonasspp.）等[19]。

芽孢桿菌屬菌是生物防治中常用的拮抗菌[20]，具有繁殖快速、生命力強、安全無毒等特點。ABDALLA S A等[21]測試了45株芽孢桿菌菌株抑制番茄早疫病菌的能力，發現其中28株有抑制鏈格孢菌生長的能力（表現出明顯的抑菌圈）。ARREBOLA E等[22]從水果表面分離出解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）PPCB004，發現其對7種不同柑橘采后的真菌病原體具有抗菌活性。巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）L2作為一種植物根系促生細菌[23]，是一種抑菌譜較廣的生防菌株[24]，針對不同植物的真菌和細菌病害均具有防治作用（如毛竹枯梢病[25]、煙草灰霉病[26]、香蕉灰斑病[26]、甘薯黑斑病[26]等），其中對真菌病原菌的抑制能力強于對細菌病原菌的抑制[27]。根據課題組前期初步研究，發現菌株L2可有效抑制鏈格孢菌的生長[28]。繼而以抑菌圈直徑評價菌株L2抗菌物質對鏈格孢菌的抑制活性，采用響應面法快速優化產抗菌物質的發酵條件，從而獲得最佳的發酵工藝來提高菌株L2的抑菌活性，有效預防由微生物侵染造成的采后果蔬腐爛現象，為研究開發新型果蔬生物防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）L2：由貴州大學真菌資源研究所分離，現保藏于中國典型培養物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC）（武漢大學），保藏號：CCTCC NO.M2012381。

鏈格孢菌（Alternaria alternata）：由貴州大學生命科學學院真菌資源研究室分離、篩選、鑒定并保存。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1 L、pH自然。

NB培養基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2（NA培養基：NB培養基中加入瓊脂15～20 g/L）。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；FA2204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；SHP-250智能生化培養箱：上海光都儀器設備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SHZ-83A離心機：榮華股份有限公司；PHS-3C精密酸度計：上海大普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與培養

將保存的巨大芽孢桿菌L2接種于NA斜面培養基上，30℃培養活化，再用接種環刮取兩環接種至NB培養液中，30℃、150 r/min培養20 h作為種子菌液。

1.3.2 發酵濾液的制備

在250mL三角瓶中裝入NB培養液后滅菌，無菌條件下向三角瓶內接入種子菌液，30℃、150 r/min培養48 h。將發酵液經5 500 r/min離心25 min，取上清液，經孔徑0.22 μm的細菌過濾器過濾，除去菌體，制得無菌發酵濾液備用。

1.3.3 抑菌活性的測定

以鏈格孢菌為指示菌，采用牛津杯法[29]對發酵液抑菌活性進行測定，活性大小以抑菌圈直徑（mm）表示。以未接種孢子懸液培養的PDA培養基作為空白對照，將牛津杯置于指示平板中央，取250 μL制備好的菌株L2無菌濾液于牛津杯中，28℃培養48h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。以上步驟均按無菌要求進行操作，每個處理設3個重復。

1.3.4 巨大芽孢桿菌L2發酵條件優化

（1）單因素試驗

碳源：以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖和山梨糖作為碳源，添加量為5 g/L，其他成分同初始培養基，配制發酵培養基。確定最佳碳源后對其進行質量濃度優化，選取質量濃度梯度為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L。

氮源：以硝酸銨、尿素、硫酸銨、酵母膏、精氨酸、谷氨酸、牛肉膏作為氮源，添加量為5 g/L，其他成分同初始培養基，配制發酵培養基。確定最佳氮源后對其進行質量濃度優化，選取質量濃度梯度為2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0 g/L、5.5 g/L、6.0 g/L。

無機鹽：以不加無機鹽的培養基為空白，在此基礎上分別加入5g/L硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、三氯化鐵、磷酸氫二鉀和碳酸鈣，其他成分同初始培養基，配制培養基。確定最佳無機鹽后對其進行質量濃度優化，選取質量濃度梯度為2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0g/L、5.5g/L、6.0 g/L。

設置菌株L2在三角瓶的接種量依次為2%、4%、6%、8%、10%、12%；pH值梯度為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；裝液量依次設為25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL；將各種影響因素在NB發酵培養基的條件上逐一改變，確定每個因素的最佳范圍。

（2）響應面法優化培養條件

在單因素、PB試驗和最陡爬坡試驗的基礎上，以抑菌圈直徑作為響應目標，利用響應面方法中的Box-Behnken Design（BBD）方法設計試驗，通過試驗數據擬合得到二階響應面模型，最終確定最優試驗條件。用Minitab軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素優化

2.1.1 碳源種類及添加量的優化

圖1 碳源對抑菌圈直徑的影響Fig.1 Effect of carbon sources on inhibitory zone diameter

不同碳源對菌株L2的抑菌效果見圖1。由圖1可知，巨大芽孢桿菌L2對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖都能很好的利用。葡萄糖作為唯一碳源時，抑菌圈直徑達到（14.55±0.43）mm，比其他糖的效果都好，故選擇葡萄糖作為菌株L2液體培養基的碳源。不同質量濃度葡萄糖的抑菌效果見圖2。

圖2 葡萄糖添加量對抑菌圈直徑的影響Fig.2 Effect of glucose addition on inhibitory zone diameter

由圖2可知，當葡萄糖添加量為15 g/L時，抑菌圈直徑最大，為（17.44±0.35）mm，故選擇15 g/L葡萄糖作為最優碳源添加量。

2.1.2 氮源種類及添加量的優化

圖3 氮源對抑菌圈直徑的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on inhibitory zone diameter

圖4 牛肉膏添加量對抑菌圈直徑的影響Fig.4 Effect of beef extract addition on inhibitory zone diameter

不同氮源對菌株L2的抑菌效果見圖3。由圖3可知，牛肉膏作為氮源時，抑菌圈直徑最大，達到（18.05±0.26）mm；其次是精氨酸、硫酸銨和硝酸銨，尿素和谷氨酸作為氮源時，抑菌圈直徑較小，故選用牛肉膏作為最適氮源。不同質量濃度牛肉膏的抑菌效果見圖4。由圖4可知，當牛肉膏添加量為4.5g/L時，抑菌圈直徑達到（24.59±0.32）mm，故選擇4.5g/L牛肉膏作為最優氮源添加量。

2.1.3 無機鹽種類及添加量的優化

不同無機鹽對巨大芽孢桿菌L2的抑菌效果見圖5。由圖5可知，巨大芽孢桿菌L2對鎂離子、錳離子、鈣離子、磷酸氫二鉀都能較好的利用，而鐵離子則抑制巨大芽孢桿菌的生長[30]，從而影響了其抑菌效果。氯化鈉對L2的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑達到（28.48±0.31）mm，故選擇氯化鈉作為發酵培養基的最適無機鹽。不同質量濃度氯化鈉的抑菌效果見圖6。由圖6可知，氯化鈉添加量為3.0g/L時優于其他質量濃度，抑菌圈直徑達到最大，為（29.71±0.27）mm。

圖5 不同無機鹽對抑菌圈直徑的影響Fig.5 Effects of different inorganic salts on inhibitory zone diameter

圖6 氯化鈉添加量對抑菌圈直徑的影響Fig.6 Effect of sodium chloride addition on inhibitory zone diameter

2.1.4 接種量的優化

接種量對菌體生長有影響，所以接種量要適度，不同接種量對抑菌效果的影響如圖7所示。由圖7可知，當接種量為6%時，抑菌圈直徑達到最大，為（24.22±0.50）mm，故選擇最佳接種量為6%。

圖7 接種量對抑菌圈直徑的影響Fig.7 Effect of inoculum on inhibitory zone diameter

2.1.5 初始pH值的優化

培養基中pH值會影響細胞代謝酶活性和營養物質的離子化程度，進而影響微生物生長代謝[31]，初始pH值對抑菌效果的影響如圖8所示。由圖8可知，當發酵初始pH值為7.0時抑菌圈直徑達到最大，為（27.33±0.26）mm，故選擇發酵pH=7.0為響應面試驗中心試驗點。

圖8 初始pH值對抑菌圈直徑的影響Fig.8 Effect of initial pH value on inhibitory zone diameter

2.1.6 裝液量的優化

圖9 裝液量對抑菌圈直徑的影響Fig.9 Effect of loading volume on inhibitory zone diameter

巨大芽孢桿菌是好氧細菌，低的裝液量使得液體培養基中溶解氧升高，滿足菌體生長和代謝的要求，使得產抗菌物質活性提高，不同裝液量對抑菌圈直徑的影響見圖9。由圖9可知，裝液量為50 mL/250 mL時，發酵液對病原菌抑菌圈直徑為（27.53±0.26）mm，比裝液量為25 mL/250 mL、75mL/250mL、100 mL/250 mL的效果好，故選擇裝液量為50 mL/250 mL。

2.2 響應面法優化培養條件

2.2.1 響應面試驗設計

通過前期PB試驗、最陡爬坡試驗確定主效應因素為牛肉膏、氯化鈉和初始pH值，并以牛肉膏4.58 g/L，氯化鈉3.23 g/L、初始pH值7.0為中心點進行設計。利用Minitab軟件的Box-Behnken設計原理，對巨大芽孢桿菌L2培養條件進行3因素3水平試驗，選擇牛肉膏（X1）、氯化鈉（X2）、初始pH值（X3）3個因素為自變量，以抑菌圈直徑（Y）為響應值，試驗設計及結果如表1所示。

表1 巨大芽孢桿菌L2發酵條件優化響應面試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of response surface experiments for fermentation conditions optimization ofBacillus megaterium L2

2.2.2 二次回歸模型的建立及檢驗

根據Minitab軟件得到擬合二階模型公式：Y=34.9533+0.3162X1+0.0812X2+0.0625X3-0.3767X12-0.2567X22-0.4242X32-0.025 0X1X2-0.032 5X1X3+0.012 5X2X3

回歸方程方差顯著性檢驗分析見表2，回歸方程模型P=0.000＜0.01，說明方程擬合度較好；失擬項P=0.122＞0.05，說明失擬不顯著，模型不失擬，選擇合理。根據表2中F（X1）=261.62，F（X2）=17.27，F（X3）=10.22，說明各因素條件對抑菌圈直徑的影響程度存在差異，各因素影響的主次順序為X1＞X2＞X3，即牛肉膏＞氯化鈉＞初始pH值。X1（牛肉膏）、X2（氯化鈉）、X3（初始pH值）對抑菌圈直徑的線性效應顯著，各因素之間交互作用對抑菌圈的交互影響不顯著（P＞0.05），X12（牛肉膏的二次項）、X22（氯化鈉的二次項）、X32（初始pH值的二次項）對抑菌圈的影響極顯著（P＜0.01）。復相關系數R2=99.29%，說明實驗值和預測值之間有較強的相關性，校正決定系數R2adj=98.02%，表明模型擬合較好。

表2 回歸方程的方差分析Table 2 Variance analysis of the regression equation

2.2.3 響應曲面的擬合及最優條件的確定

固定其中的一個因素，利用Minitab軟件做另外兩個因素交互作用的曲面圖及等值線圖，確定牛肉膏、氯化鈉及初始pH值對抑菌圈直徑的影響。結果見圖10。

由圖10可知，牛肉膏、氯化鈉、初始pH值相互作用對菌株L2抑菌活性的影響均出現拋物面型關系，所得到的響應面都存在一個極大值點，其中牛肉膏與初始pH值之間的交互作用最為明顯。

經過響應面優化，根據擬合二階模型公式得到理論上的培養基配方為牛肉膏添加量4.58 g/L，氯化鈉添加量3.23 g/L，初始pH值為7.0時，抑菌圈直徑最大為34.77 mm。為了驗證所得到的最佳培養基組成是否可靠，同時考慮了實際操作的可行性，將培養基成分調整為牛肉膏添加量4.6 g/L、氯化鈉添加量3.0 g/L，初始pH值為7.0，進行3次重復試驗，得到L2抑菌圈直徑為（34.99±0.14）mm，與預測值34.77 mm擬合度高，說明該模型能很好得模擬和預測實驗結果，證實了模型的有效性。

圖10 牛肉膏、氯化鈉和初始pH值交互作用對抑菌圈大小影響的響應曲面和等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between beef extract,NaCl and initial pH value on inhibitory zone diameter

3 結論

本試驗以病原真菌鏈格孢菌為指示菌，在單因素的基礎上，利用響應面法對巨大芽孢桿菌L2抗菌性能的發酵條件進行了研究，結果得到最優發酵條件：葡萄糖添加量15 g/L，牛肉膏添加量4.6 g/L，氯化鈉添加量3.0 g/L，初始pH為7.0，裝液量50 mL/250 mL，接種量6%，優化后發酵液抑菌圈直徑為（34.99±0.14）mm，比原始發酵條件下的抑菌圈直徑為（14.55±0.43）mm提高了140.48%。試驗篩選出牛肉膏、氯化鈉和初始pH值為主效應因素，說明培養基成分與酸堿性對菌株L2產生抑菌物質的影響較顯著，為后續進一步優化發酵條件和投入生產提供依據。但本研究是在實驗室搖瓶條件下進行，要實現工業化大規模開發生產，還需進一步培養工藝的研究。