不同時期摘葉對馬瑟蘭花色苷的影響

王安妮，肖慧琳，張超杰，鄭秋玲，王 婷，唐美玲*

（山東省煙臺市農業科學研究院，山東 煙臺 265500）

馬瑟蘭是法國利用赤霞珠和歌海娜雜交育成的品種，近年來在煙臺產區表現良好，長勢中庸，果穗松散，顏色較好，抗病性強，栽培面積逐年增加。如何進一步提高其果實品質釀出具有產區特色的葡萄酒是目前急需解決的生產問題。

花色苷是釀酒葡萄與葡萄酒中至關重要的一類物質。葡萄果實和葡萄酒呈現出的顏色主要是由花色苷組分和含量決定，而顏色是評價葡萄果實和葡萄酒品質的一項重要依據[1]。葡萄品種中含有的花色苷組分主要由遺傳因素決定[2]，但目前也有研究表明，環境因素和管理方式也會影響花色苷的組分和含量[3-6]。近年來國內外對于果際微氣候調控對釀酒葡萄果實花色苷的影響開展了很多研究。大多數的釀酒葡萄適宜摘葉的時期是快速著色期，但不同品種和不同產區之間也有些許差異。LEMUT M S等[7]在維帕瓦谷測定的黑比諾表示在坐果期摘葉處理最佳。雷玉娟等[8]在新疆地區采用不同時期結合不同摘葉的方式處理赤霞珠，表明轉色后半摘葉和采收前全摘葉均提高了果實含糖量，有利于花色苷的合成；張國濤等[9]在香格里拉分五個時期對赤霞珠進行摘葉處理，表示在轉色前期及中期效果較好。

為進一步明確果際微氣候調控對煙臺產區馬瑟蘭果實中花色苷的影響，本研究擬通過轉色期前、后兩個時期對果穗周圍葉片進行摘葉處理，探究馬瑟蘭果實中花色苷組分和含量的變化，為提高煙臺產區馬瑟蘭品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種為馬瑟蘭980，均采自于山東省煙臺產區蓬萊龍湖酒莊。

花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷及二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷：Miragen公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜（high efficiencyliquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技有限公司；BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；AA-56311有機相過濾器：安捷倫科技有限公司；H13237型超純水器：四川優普超純科技有限公司；IKA MS3 basic渦旋振蕩器：艾卡儀器設備有限公司；Centrifuge 5430R高速離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計

本次試驗選擇生長健壯，長勢一致的植株，每10棵樹為一個處理，重復3次，各處理隨機排列。分別在轉色前（花后35 d）和全部轉色結束后（花后65 d）兩個時期在果穗上下各摘除1片葉，不摘葉做對照。

1.3.2 果皮花色苷的提取

果實成熟時每個處理隨機取樣100粒漿果，樣品采集后放入冰盒帶回實驗室剝取果皮放入液氮中速凍，然后用研缽磨成粉末放入真空冷凍干燥機-40℃下冷凍干燥24 h，果皮粉保存在-40℃冰箱內備用。準確稱量0.2 g放入研缽，加入1.5 mL的提取液（甲酸∶水∶甲醇=2∶28∶70）繼續研磨至無明顯顆粒狀，并用移液槍吸取1 mL于離心管中。室溫下1500r/min避光搖床振蕩10min，然后4℃條件下13000r/min低溫離心10 min，取上清液經0.22 μm的濾膜過濾并收集到離心管內。-80℃保存待測上機。

1.3.3 果皮花色苷的定性和定量

花色苷采用高效液相色譜技術測定。色譜條件如下：KromasilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速1.0mL/mim；柱溫30℃；進樣量20 μL；檢測波長525 nm；流動相A甲酸∶水=1∶9，B甲酸∶乙腈=1∶9。

采用外標法進行定性和定量分析。準確稱取花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷這5種標準品用10%的甲酸溶液配制成質量濃度為10mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的標準液，經0.22 μm濾膜過濾后，在確定的色譜條件下上機測定，擬合5種花色苷的質量濃度（Y）和峰面積（X），得到標準曲線方程進行定量分析。相關系數均在0.999 2以上，線性關系良好，符合高效液相色譜的標準。其他各類酰化花色苷參考梁振昌的[10]測定結果推斷色譜峰代表成分。

2 結果與分析

2.1 花色苷組分和相對含量對比分析

如表1所示，轉色后摘葉處理組中檢測出的數量與對照組相同，而轉色前摘葉處理組中共檢測出16種花色苷單體。除了對照組中的那12種葡萄糖苷花色苷之外，還多檢測出2種單葡萄糖苷花色苷單體和2種雙葡萄糖苷花色苷。雖然大多數研究結果表明歐亞種葡萄中只含有單葡萄糖苷花色苷，但也有少數研究表明，一些歐亞種中也存在少量雙糖苷[11-14]，其在葡萄酒中的顏色和穩定性具有雙重特性。在新酒中，雙糖苷花色苷在熱和光下的穩定性好于花色素單糖苷，但在葡萄酒的成熟和陳釀過程中是非常不穩定的[15-16]。至于本研究中轉色前摘葉增加果實中的雙糖苷花色苷對于后期葡萄酒呈色的影響有待于進一步研究。

表1 三種處理馬瑟蘭葡萄皮中花色苷的分析Table 1 Analysis of anthocyanins in grape skins of Marselan with three types of treatments

煙臺產區馬瑟蘭果實中花色苷種類主要是五類，包括花翠素類、花青素類、甲基花翠素類、甲基花青素類和二甲基花翠素類，沒有檢測到花葵素類。其中相對含量最高的就是二甲基花翠素類，相對含量最低的是花青素類，這與多個研究結果一致[17-19]，摘葉處理沒有改變這個趨勢。三個處理對照組中二甲基花翠素類相對含量最高為92.06%，轉色前摘葉組的相對含量最低為87.51%；花青素類相對含量最低的是對照組為0.36%，而轉色前摘葉處理的相對含量最高為0.57%。轉色前摘葉處理組中除了二甲基花翠素類相對含量低于對照和轉色后摘葉的，其余四大類相對含量都要高于對照和轉色后摘葉的。轉色后摘葉的除了花翠素和二甲基花翠素類相對含量略低于對照組，其他三類相對含量高于對照組。

煙臺產區馬瑟蘭果實中的花色苷以未酰化、香豆酰化、咖啡酰化和乙酰化四種形態存在。轉色前摘葉組相對含量的高低順序為香豆酰化花色苷＞未酰化花色苷＞乙酰化花色苷＞咖啡酰化花色苷。轉色后摘葉處理與對照基本相似，只是相對含量比對照稍高，為45.68%。但轉色前摘葉處理中含量最高的是未酰化花色苷，為45.27%，其次才是香豆酰化花色苷，為35.07%，并且三種酰化形式花色苷相對含量都要少于轉色后摘葉處理和對照組。由此可以看出，轉色前摘葉在一定程度上抑制了花色苷的甲基化和酰化，這與PASTORE C等[20-21]的研究結果是一致的，漿果成熟過程中長時間高溫灼燒或者曝光能顯著減少花色苷的甲基化和酰化程度。

如表2所示，三種處理方式共檢測到花翠素類3種，花青素類2種，甲基花翠素類3種，甲基花青素類3種，二甲基花翠素類5種。轉色前摘葉處理組比對照組多檢測到2種單葡萄糖苷花色苷單體（花青素-3-O-葡糖苷、甲基花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷）和2種雙葡萄糖苷花色苷（花翠素-3-O-（6-O-對香豆酰）葡糖苷-5-O-葡糖苷和二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆酰）葡糖苷-5-O-葡糖苷）。轉色后摘葉處理組和對照處理組檢測的花色苷單體種類一致。

表2 三種處理馬瑟蘭葡萄皮中花色苷的相對含量Table 2 Relative percentage of anthocyanins in Marselan grape skins with three types of treatments

轉色前摘葉中相對含量最高的是二甲基花翠素-3-O-葡糖苷花色苷，為39.36%，其次是二甲花翠素-3-O-（6-O-對香豆酰）葡糖苷，相對含量為29.68%，再次是二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷，相對含量為16.53%，三者共占了總花色苷的85.57%；而轉色后摘葉處理和對照組中二甲花翠素-3-O-（6-O-對香豆酰）葡糖苷含量最高，分別為40.85%和39.70%，其次是二甲花翠素-3-O-葡糖苷，相對含量分別為29.45%和30.82%；再次是二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷，相對含量分別是18.07%和18.88%，三者共占了總花色苷的88.37%和89.40%。

2.2 五種基本花色苷含量對比

由表3看出，在相同的稱樣質量和處理方法下，對照中只檢測出4種基本花色苷，沒有檢測出花青素-3-O-葡糖苷。轉色前摘葉檢測出5種，其含量最高的是二甲基花翠素-3-O-葡糖苷367.5mg/kg；含量最低的是花翠素-3-O-葡萄苷，只有19.17 mg/kg。轉色后摘葉處理也是檢測到4種基本花色苷，只是含量較對照略高。而轉色前摘葉處理中檢測出了5種基本花色苷，比對照增加了花青素-3-O-葡糖苷，但含量極少，僅為9.81 mg/kg。有研究表明，葡萄果實中花青素-3-O-葡糖苷含量低不僅是因為它是甲基化及酰化花色苷的前體物質[22-23]，而且它在B環上含有的O-酚類中相鄰的羥基官能團對酶較為敏感，更易氧化[24]。本研究中只有轉色前摘葉處理組中檢測出該類花青素，進一步說明了曝光能顯著減少花色苷酰化程度，與PASTORE C等[20-21]研究結果一致。

表3 三種處理下馬瑟蘭葡萄果皮中5種花色苷含量Table 3 Contents of five kinds of anthocyanins in the Marselan grape skins with three types of treatments mg/kg

從五種基本花色苷含量分析，轉色前、后摘葉均能增加花色苷的含量，而轉色前摘葉處理效果更為顯著。轉色前摘葉處理的五類基本花色苷總量達到1 438.68 mg/kg，是對照組的3.16倍。其中含量最高的是二甲花翠素-3-O-葡糖苷（1177.85mg/kg），是對照組的3.21倍。而轉色后摘葉處理的五類基本花色苷總量為509.98mg/kg，含量略高于對照組（454.45 mg/kg）。這與MATSUYAMA S等[25-26]的研究結果一致，適當的摘葉處理可以增加花色苷含量及改變單體的組分。通過果際微氣候調控改善果實的光照條件，一方面增加了花色苷的合成底物，另一方面促進了花色苷合成相關酶的活性以及基因的表達[27-29]。而本研究試驗結果的獲得是通過促進哪些基因的表達需要進一步探究。

3 結論

在煙臺產區，摘葉措施能夠有效增加馬瑟蘭釀酒葡萄中花色苷的單體種類和含量，并且轉色前處理優于轉色后處理。轉色前處理比對照多檢測出4種單體，增加了雙葡萄糖苷花色苷的數量，但降低了花色苷的酰化程度，其基本花色苷總量是對照的3.16倍；轉色后處理與對照組的花色苷單體種類相同，其花色苷總量略高于對照組。不同摘葉處理對于馬瑟蘭葡萄酒的影響還在進一步研究當中。