溫度對濃香型白酒發酵的影響

應 靜，游 玲，邱樹毅，王 濤，傅小紅，羅明有，雷春瓊，馮學愚*

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.宜賓學院 發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.成都師范學院 化學與生命科學學院，四川 溫江 611130；4.四川省宜賓市敘府酒業有限公司，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒是典型的自然混菌、泥窖續糟發酵產品[1-2]，影響發酵的因素眾多，長期生產經驗及研究表明，溫度是發酵過程中的重要影響因素之一[3-5]。溫度可通過影響微生物生長代謝及其一系列生化反應過程影響酒的產量及質量[6-7]，因此，準確了解溫度對白酒發酵過程的影響極其重要。當前通過人為控溫了解溫度對白酒發酵的影響研究相對較少。羅明友[8]證實在不加窖泥的基礎上以黃水為接種劑進行濃香型白酒窖外控溫發酵是可行的；張鑫[9]以地上不銹鋼槽控制發酵溫度的方式生產汾酒，出酒率略有降低，酸度略有升高；蒲嵐等[10]發現，控溫發酵不會造成酒體風格的改變，可提高糟醅總酯含量；陳丙友等[11]發現，清香型白酒地缸發酵中存在溫度場，溫度及其變化模式對微生物群落生長和代謝產生顯著影響。采用泥窖續糟發酵工藝的濃香型白酒，由于窖池體系龐大，糟醅溫度受環境因素影響大，且窖池內部不同位置、不同層次糟醅存在較大溫度差，難以實現整個體系糟醅溫度均勻一致，控溫發酵作為中國白酒生產從傳統方式向機械化、標準化轉變的關鍵技術之一[12-13]，亟待開展控溫發酵機理、控溫模式、控溫方式等方面的系統研究。

本研究以傳統濃香型白酒發酵工藝為基礎，在實驗室條件下用玻璃壇模擬濃香型白酒發酵，并對發酵過程進行溫度控制，通過監測發酵過程糟醅理化指標變化，采用稀釋涂布平板分離計數法檢測典型微生物數量變化，氣相色譜（gas chromatography，GC）結合外標法比較不同控溫條件出壇糟醅主要揮發性風味物質組成及含量，運用主成分分析（principal component analysis，PCA）以直觀了解不同溫度與對照窖池出池糟醅風味成分的總體差異，探究溫度對濃香型白酒發酵的影響，為人工定向控制發酵、實現白酒行業科學化和標準化生產奠定基礎，以豐富濃香型白酒發酵機理的理論闡釋。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

糟醅樣品：取自宜賓某知名多糧濃香型白酒企業準備入窖的拌曲糟醅，黃水為入窖糟窖池上一輪發酵黃水，窖泥為該酒廠特制封窖泥；正丙醇、異丁醇、正丁醇、正己醇、β-苯乙醇、乙醛、異丁醛、糠醛、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯等多組分混合標樣（均為色譜純）：鄭州譜析科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

營養瓊脂培養基、虎紅瓊脂培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。培養基滅菌條件121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Basis Hei-VAP-ML旋轉蒸發儀：德國Heidolph設備生產公司；Agilent 7890A氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；PHSJ-5精密pH計：上海儀電電子股份有限公司；mj-250-1恒溫培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；1M探頭式電子測溫儀：廣州偲瑞電子科技有限公司；LZ-1L玻璃壇：四川省瀘州市晶盛玻璃廠。

1.3 方法

1.3.1 發酵實驗方法

取72個121℃滅菌20 min的1 L玻璃壇作發酵容器，壇內依次裝入充分混勻的待入窖糧糟0.8 kg、3%入壇糟窖池上一輪發酵黃水[14-15]、溫度探頭，封窖泥封壇。發酵初始階段，所有發酵壇統一放在溫度為22℃左右的實驗室自然發酵8d。8d后將發酵壇隨機分成三等份，分別放入高（36℃）、中（30℃）、低（24℃）三個溫度[16-17]的培養箱中恒溫培養52d，發酵周期為60d。糟醅入壇前取一次樣，從入壇開始到發酵結束，前16 d每4 d取一次樣，后44 d每11 d取一次樣，取樣時取每壇充分混勻的糟醅200 g，各溫度條件下分別取樣，同一溫度條件取3個發酵壇做平行試驗，進行微生物計數、理化指標分析。

1.3.2 溫度監測

以預先埋入發酵壇內的溫度探頭監測糟醅中心位置溫度變化情況；高（36℃）、中（30℃）、低（24℃）三個恒溫培養箱維持不同發酵條件的溫度需要，數顯溫度計檢測培養箱實時溫度。

1.3.3 理化指標檢測

水分含量測定：烘干法[1]；酒精度測定：蒸餾法結合酒精計法[1]；酸度測定：酸堿中和滴定法[1]；還原糖含量測定：斐林試劑法[18]；淀粉含量測定：酸水解結合斐林試劑法進行測定[18]。

1.3.4 典型微生物培養計數

采用稀釋涂布平板分離計數法對微生物進行計數[18]：好氧細菌培養溫度為37℃，培養基為營養瓊脂培養基；酵母菌、霉菌培養溫度為30℃，培養基為虎紅瓊脂培養基。

1.3.5 風味物質檢測

蒸餾法結合氣相色譜法分析。稱取100 g出壇糟醅樣品，加入200 mL蒸餾水，蒸餾得100 mL溜出液，過濾備用。氣相色譜分析條件：采用Lzp930毛細管柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣體積：1 μL；載氣流速：氮氣（N2）1.5 mL/min；分流比：40∶1；進樣口溫度：250℃；氫火焰離子化檢測器250℃；柱溫升溫程序：35℃保持5min，以5℃/min升至100℃，再以10℃/min升至210℃，最后210℃保持10min。相同條件下測定糟醅的平行樣，數據取平均值。

1.3.6 主成分分析

單獨比較不同溫度下出壇糟醅風味成分差異無法得到一個總體上的評價，主成分分析是一種通過降維，將原始變量重新組成一組新的互相無關的幾個綜合變量，通過確定少數幾個主要因子來表示原來樣本中多個復雜的變量，進而代替原始變量的多元統計分析方法[19]。采用SPSS 19.0數據分析軟件對發酵60 d的低溫出壇糟醅L-1、L-2、L-3，中溫出壇糟醅M-1、M-2、M-3和高溫出壇糟醅H-1、H-2、H-3及窖池出窖糟醅C0共10個糟醅樣品的主要風味物質進行主成分分析，以直觀了解不同溫度糟醅之間的差異。

2 結果與分析

2.1 不同控溫條件下糟醅溫度變化

不同控溫條件下糟醅溫度變化如圖1所示。由圖1可知，糟醅入壇發酵初始溫度為20℃左右，符合濃香型白酒發酵“低溫入窖”特點[20]。發酵前8 d，各發酵壇溫度較低且呈緩慢上升趨勢，可能是因為入壇溫度低，霉菌和酵母菌等微生物利用糟醅中的空氣和營養物質開始進行繁殖代謝，產生一定的熱量，使發酵壇內溫度緩慢升高，與濃香型白酒發酵“前緩”規律一致，有利于控酸產酯，說明發酵正常。從第8天開始，發酵壇被分別放入溫度設定為36℃、30℃和24℃的培養箱中恒溫培養。除發酵第22天實驗室停電，溫度突然下降外，三個溫度條件下糟醅溫度與培養箱溫度一致，由于是用小體積發酵壇在實驗室條件下模擬大生產使用的窖池，糟醅發酵溫度受環境影響大，加之培養箱溫度恒定不變，因此在整個發酵過程中發酵溫度得到有效控制，糟醅溫度基本穩定。

圖1 發酵過程中不同控溫條件下糟醅溫度的變化Fig.1 Changes of temperature of fermented grains under different temperature-controlled conditions during fermentation process

2.2 溫度對糟醅理化性質的影響

2.2.1 溫度對糟醅水分含量的影響

圖2 發酵過程中不同控溫條件下糟醅中水分含量的變化Fig.2 Changes of moisture in fermented grains under different temperature-controlled conditions during fermentation process

由圖2可知，糟醅入壇水分在56%左右，稍高于窖池發酵的入窖水分，與糟醅裝壇時接入了3%左右入壇糟窖池上一輪發酵黃水有關。不同控溫條件下糟醅最終水分含量差異明顯，發酵60 d時，36℃條件下糟醅出壇水分含量最低為61.4%，30℃條件下糟醅出壇水分含量為64.5%，24℃條件下糟醅出壇水分含量最高達66.3%，出入壇水分增幅在5.4%～10.3%，水分含量隨溫度增加而減少，可能與高溫加快水分蒸發有關。

2.2.2 溫度對糟醅淀粉、還原糖含量、酒精度和酸度的影響

圖3 發酵過程中不同控溫條件下糟醅理化指標的變化Fig.3 Changes of physicochemical indexes of fermented grains under different temperature-controlled conditions during fermentation process

由圖3A可知，不同控溫條件下糟醅淀粉含量隨發酵時間在0～60 d范圍內都呈下降趨勢，36℃條件下發酵糟醅殘淀粉含量下降較慢，最終含量較30℃、24℃殘淀粉含量高1%左右，說明控溫發酵對淀粉含量變化影響較小，與羅冰等[3]的窖內研究一致。

由圖3B可知，三種溫度發酵糟醅中還原糖含量在12～16 d發酵過程中不斷減少，36℃發酵糟醅在16 d左右還原糖停止減少，后期還原糖含量不降反升，酒精度也不再明顯上升，說明較高溫度影響酒化過程，造成還原糖累積。

由圖3C可知，36℃發酵糟醅在16 d左右酒精度不再明顯上升，其最終酒精度為1.52%vol，說明較高溫度影響酒化過程，出酒率低，與陳丙友等[11]研究規律一致；而24℃發酵糟醅中，由酵母轉化還原糖生成乙醇一直持續到發酵結束仍在進行，最終酒精度達4.67%vol，表明較低溫度酵母菌不易衰老，傾向于“柔儼”型發酵，使最終酒精度較高；30℃發酵糟醅在27 d左右完成主發酵，最終酒精度為2.98%vol，變化趨勢與窖池相似[21]。說明24℃低溫條件導致產酒不徹底，需延長發酵期，不利于企業效益的提高，30℃控溫發酵與實際生產接近，36℃較高溫度條件嚴重影響產酒，不利于濃香型白酒發酵，24～30℃控溫范圍有利于酵母菌發酵產酒。

由圖3D可知，控溫開始，36℃發酵糟醅在第12天開始大幅生酸，而中、低溫糟醅第16天才開始，且24℃升酸最慢，說明溫度對產酸微生物的代謝有促進作用。發酵38～49 d，酸度略有下降，不同溫度糟醅酸度都下降約0.4 mmol/10 g，分析可能是這一階段醇酸酯化反應使酸度降低，49 d直至發酵結束，糟醅酸度出現回升，結合此時壇內發酵環境，推測壇內酸的生成與部分兼性厭氧菌和厭氧菌代謝產酸有關。最終30℃發酵糟醅酸度略大于24℃，在5.2 mmol/10 g左右，高于出窖糟醅適宜酸度范圍3.0～4.5 mmol/10 g[22]，推測一方面可能是因為發酵周期長，另一方面可能與出壇糟醅未進行“滴窖”過程有關，36℃控溫發酵糟醅酸度為4.2 mmol/10 g，低于中低溫發酵糟醅，產生這一現象的原因可能是36℃發酵糟醅溫度較高，有機酸揮發較快，同時高溫有利于醇酸酯化反應，導致最終酸度偏小。

2.3 溫度對糟醅微生物數量變化的影響

2.3.1 溫度對糟醅好氧細菌數量變化的影響

圖4 發酵過程中不同控溫條件下糟醅中好氧細菌數量的變化Fig.4 Changes of aerobic bacteria amounts in the fermented grains under different temperature-controlled conditions during fermentation process

由圖4可知，0～12 d三種不同溫度條件下糟醅好氧細菌數量變化趨勢相似，都呈現出先增加，隨后下降的趨勢，好氧細菌數量在第8天達峰值，這是由于發酵初期糟醅含氧相對豐富，好氧細菌大量增殖，隨著氧氣的減少及酒精和酸的生成，好氧細菌出現死亡，細菌總數下降，中、高溫發酵糟醅在第16天出現第2個峰值，低溫發酵糟醅遲于中、高溫糟醅，在27天出現峰值，推測與兼性厭氧細菌的增殖有關[2]，低溫發酵糟醅生酸產酒過程相對緩慢，使得其出現第2個峰值的時間晚于中、高溫糟醅，且好氧細菌總數較中、高溫糟醅大。隨著發酵的進行，糟醅環境條件不再適合好氧細菌，好氧細菌數量不斷減少，直至發酵結束，三個不同條件下好氧細菌數量很低且無明顯差異。

2.3.2 溫度對糟醅酵母菌數量變化的影響

酵母菌是白酒發酵過程中產酒產酯極其重要的微生物之一[1]。

圖5 發酵過程中不同控溫條件下糟醅中酵母菌數量的變化Fig.5 Changes of yeast amounts in the fermented grains under different temperature-controlled conditions during fermentation process

由圖5可知，酵母菌數量在不同溫度白酒發酵過程中總體變化規律相同，都是在發酵初期（0～12 d）快速增長，隨后數目開始下降，不同之處在，發酵中期（12～28 d），低溫發酵糟醅酵母菌數量遠多于中、高溫發酵糟醅，36℃發酵糟醅酵母數量最少，接近于0。酵母菌最適生長溫度為20～30℃，過高溫度不適于酵母菌生長，容易使其過早衰老死亡。

2.3.3 溫度對糟醅霉菌數量變化的影響

圖6 發酵過程中不同控溫條件下糟醅中霉菌數量的變化Fig.6 Changes of molds amounts in the fermented grains under different temperature-controlled conditions during fermentation process

由圖6可知，不同控溫條件下霉菌數量變化趨勢基本相同，說明溫度對霉菌數量的變化無顯著影響。霉菌數量在第8天達到峰值，為750 000個/g糟醅，后急劇下降，到發酵后期，基本檢測不到霉菌。

2.4 溫度對糟醅主要揮發性風味物質變化的影響

采用氣相色譜結合外標法對不同控溫條件下出壇糟醅樣品的主要揮發性風味物質進行檢測[23]，結果見表1。由表1可知，三個控溫條件下共檢測出18種主要揮發性風味物質，包括7種酯類物質、8種醇類物質和3種醛類。

表1 不同控溫條件下糟醅中主要揮發性風味成分及含量檢測結果Table 1 Determination results of main volatile flavor components and contents in the fermented grains under different temperaturecontrolled conditions

2.4.1 溫度對糟醅醇醛類物質含量變化的影響

從3種不同控溫條件發酵糟醅中共檢測到8種主要醇類物質和3種醛類物質，分別是正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、β-苯乙醇、甲醇、乙醛、異丁醛和糠醛，不同溫度糟醅醇醛類物質含量見圖7。

由圖7可知，高級醇類物質異戊醇、異丁醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正戊醇的生成都隨發酵溫度增加而減少，其中正丁醇變化尤為明顯，隨溫度降低，含量成倍增長，造成這一現象的原因可能是酵母與多種高級醇的生成密切相關[24]，而溫度偏高使主發酵期提前結束，產高級醇類酵母過早衰老死亡，醇類物質生成少，中、高溫發酵糟醅中檢測到的高級醇類物質總含量僅為7.42 mg/100 g、7.74 mg/100 g，而24℃較低溫度發酵糟醅主發酵期更長，高級醇類物質總含量達9.720 mg/100 g，β-苯乙醇隨溫度變化無明顯規律。24℃低溫發酵糟醅中沒有檢測到甲醇含量，30℃發酵糟醅中甲醇含量為0.001 mg/100 g，低于36℃甲醇含量的0.004mg/100g，甲醇含量隨溫度降低而減少，說明低溫有利于減少甲醇的生成量[25]?？啡﹥H在高溫（36℃）發酵糟醅中檢測到，含量為1.901 mg/100 g，可能是糠醛主要由發酵過程中美拉德反應等熱反應過程生成，偏高溫有利于美拉德反應，從而增加糠醛含量，與楊國先等[26]的研究相似。故在濃香型白酒生產過程中，為了降低糠醛物質含量，除生產中少用谷糠、稻殼外，還應注意控制發酵溫度。

圖7 不同控溫條件糟醅中醇醛類物質含量的變化Fig.7 Changes of alcohols and aldehydes contents in the fermented grains under different temperature-controlled conditions

2.4.2 溫度對糟醅酯類物質含量變化的影響

發酵糟醅中共檢測到7種酯類物質，分別是己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸異戊酯、乙酸丙酯。不同控溫條件下酯類組成及含量見圖8。

圖8 不同控溫條件糟醅中酯類物質含量的變化Fig.8 Changes of esters content in the fermented grains under different temperature-controlled conditions

由圖8可知，不同控溫條件下總酯差異明顯，30℃控溫發酵糟醅總酯含量為109.12 mg/100 g，較24℃發酵糟醅總酯含量96.64 mg/100 g大，說明溫度偏高，酯化酶活力稍大，對酯化反應有促進作用，與萬清徽等[27]研究規律一致。而36℃控溫發酵糟醅總酯最終含量較30℃、24℃少，僅為69.99 mg/100 g，產生這一現象的原因推測是高溫有利于酯類化合物的生成[28]，但過高溫度一方面加速酯類物質揮發，與陳玉香等[29]的研究相似；另一方面使產酯酵母早衰，最終導致較高溫度發酵（36℃）糟醅中酯類物質最少，而30℃總酯含量大于24℃。實驗還發現，不同溫度梯度下糟醅中各酯類物質組成極不平衡，尤其乳酸乙酯和己酸乙酯相對含量，其中乳酸乙酯含量遠大于己酸乙酯，分析原因可能是本實驗所用發酵壇體系小，厭氧條件不夠，使壇內發酵環境利于乳酸菌代謝產乳酸，己酸數量有限，產己酸少，最終導致己酸乙酯的生成少于乳酸乙酯，與潘玲玲等[30]研究結果一致。

2.4.3 糟醅主要揮發性風味物質的主成分分析

為直觀了解不同溫度下發酵糟醅風味成分的總體差異，對3種不同控溫條件下及出池對照糟醅共10個糟醅蒸餾樣品進行主成分分析，主成分分析得分圖見圖9。

圖9 不同控溫條件下糟醅與對照窖池糟醅風味物質PCA得分圖Fig.9 PCA scores of fermented grains and control group under different temperature-controlled conditions

由圖9可知，提取了兩個主成分，第1個主成分能夠解釋原始風味組分的方差為46.53%，第2個主成分能夠解釋原始風味組分的方差為25.13%，前兩個主成分總共可解釋71.66%的原變量信息，能較大程度地反映糟醅風味組分差異。不同控溫條件下糟醅樣品能較好區分開。其中高溫發酵（36℃）的H-1、H-2、H-3集中分布在第三象限，與中、低溫發酵糟醅樣品明顯不同，可歸納為一類；低溫發酵（24℃）的L-1、L-2分布較為靠近，集中在第四象限可歸為第二類；低溫發酵（24℃）的L-3與中溫發酵（30℃）的M-1、M-2、M-3及出池糟醅C0在得分圖上分布更為接近，可歸納為第三類。這說明不同溫度對白酒發酵糟醅風味的生成有重要影響，中溫發酵糟醅與窖池發酵糟醅風味構成更相似。第二類和第三類在得分圖上明顯區別于第一類，表明中溫（30℃）、低溫（24℃）及窖池發酵糟醅風味組分構成明顯不同于高溫（36℃）發酵糟醅，與前面所述高溫（36℃）不適合濃香型白酒發酵相一致。

3 結論

利用實驗室模擬傳統濃香型白酒發酵探討溫度對濃香型白酒發酵過程的影響，在本實驗條件下，可得出以下結論：高溫（36℃）發酵生酸快，酵母及霉菌數量減少快，主發酵期結束較早，高級醇類物質含量為7.74 mg/100 g，糠醛含量為1.90 mg/100 g。低溫（24℃）發酵產酒率最高，好氧細菌及酵母菌數量大且持續時間長，高級醇含量為9.72 mg/100 g，未檢測到甲醇和糠醛物質。中溫（30℃）發酵有利于最終酯類生成，含量為109.12 mg/100 g，其總體風味主成分分析結果與出窖糟醅更為接近。

根據研究結果，在本實驗條件下，發酵溫度宜在30℃左右，并可以通過控制發酵溫度生產特定基酒。企業根據自身需要，選擇通過控溫發酵來解決生產實際問題，如生產中出酒率高，要增加酯類物質含量、減少高級醇生成，可控制發酵溫度在30～36℃之間；酯類物質足夠而出酒率偏低，可控制發酵溫度在24～30℃之間。由于本研究以小體積發酵壇作發酵容器，盡管實現了對發酵溫度的有效控制，但乙醇及風味物質的揮發也是實驗誤差的主要來源，因此，上述結論還需要通過窖內發酵進一步驗證。