海洋尿酸氧化酶菌株發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化

逄 飛，周新尚，肖景惠，張慶芳，竇少華*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

尿酸氧化酶（urate oxidase）EC 1.7.3.3是參與生物體內(nèi)核酸代謝的一種重要的氧化酶。尿酸的嘌呤環(huán)能被尿酸氧化酶催化開放，使尿酸被分解為尿囊素、二氧化碳和過氧化氫。尿酸的溶解度是尿囊素的1/10～1/5，尿酸被分解為尿囊素從而排出體外。該酶存在于哺乳動物，昆蟲，植物，微生物中[1-4]。但是，人類和其他高等靈長類動物由于相關(guān)基因缺失而不能產(chǎn)生尿酸氧化酶[5]。因此，尿酸才是人類和某些猿類嘌呤代謝的終產(chǎn)物。尿酸氧化酶的來源非常廣泛，尿酸氧化酶最早被SCHITTENHELM發(fā)現(xiàn)，他從牛的腎臟中提純了此酶[6]。隨著生命科學(xué)和化學(xué)的不斷發(fā)展，極大豐富了尿酸氧化酶的來源，并對尿酸氧化酶的性質(zhì)進(jìn)行研究[7]。其中，從微生物中發(fā)現(xiàn)尿酸氧化酶是尿酸氧化酶研究的重要進(jìn)步。20世紀(jì)70年代，BONGAERTS G P等[8]發(fā)現(xiàn)苛求芽孢桿菌（Bacillus fastidious）能產(chǎn)生尿酸氧化酶，并且其能把尿酸作為唯一碳源。此后，不同微生物來源的尿酸氧化酶不斷被發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)研究了許多產(chǎn)生尿酸酶的微生物，例如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomona aeruginosa）、黃曲霉（Aspergillus flavus）和產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis），其生產(chǎn)尿酸氧化酶的能力已經(jīng)被研究[6]。從微生物中分離出的尿酸氧化酶絕大多數(shù)都是胞內(nèi)酶。大多數(shù)的尿酸氧化酶菌株都是從土壤樣品中篩選得到的[4，9-10]，降解物著色法、水解圈法及透明圈法[11]等是較為常用的篩選方法。現(xiàn)在報道比較多的尿酸氧化酶的產(chǎn)生菌主要有芽孢桿菌、真菌、酵母等[11]，但是篩選方法大都是選擇的透明圈法，因為這種篩選的方法操作簡單。從海洋中篩選尿酸氧化酶菌株少見報道。因此，本研究從大連黃海海泥中分離出一株尿酸氧化酶高產(chǎn)菌苛求芽孢桿菌（Bacillus fastidious）菌株Z7-1，通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化其發(fā)酵條件，首先基于Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計找出重要影響因子，然后經(jīng)DesignExpert.V8.0.6軟件中響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計對響應(yīng)過程變量進(jìn)行數(shù)學(xué)建模及分析，進(jìn)一步優(yōu)化響應(yīng)因子，確定最優(yōu)發(fā)酵條件，目的是提高尿酸氧化酶的活力，從而為該尿酸氧化酶更深入研究及中試實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

苛求芽孢桿菌（Bacillus fastidious）Z7-1：大連黃海海域海泥中篩選出來的Z7菌株經(jīng)紫外（ultraviolet，UV）-亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）復(fù)合誘變得到，保藏在遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 化學(xué)試劑

尿酸、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、瓊脂粉（均為生化試劑）：生物工程上海股份有限公司。其他實驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：尿酸5 g，酵母膏3 g，NaCl 0.1 g，MgSO40.5g，K2HPO42.0g，KH2PO40.5g，pH7.5，0.1MPa滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：尿酸5 g，酵母膏3 g，NaCl 0.1 g，MgSO40.5g，K2HPO42.0g，KH2PO40.5g，pH7.5，0.1MPa滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱、DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計：尼柯儀器有限公司；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

在無菌條件下，將斜面保藏的菌株Z7-1接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，作為一級種子液。用移液槍吸取5%的一級種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)中，同樣條件培養(yǎng)24 h，作為二級種子液。

1.3.2 粗酶液制備方法

取發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min，離心獲得的濕菌經(jīng)pH8.5的硼酸緩沖溶液洗滌3次以上，直至發(fā)酵液洗凈為止。將洗滌后的菌體懸浮于pH8.5的硼酸緩沖溶液中，冰浴條件下超聲波破碎，能量30%，每次破碎3s，間隙3s，破碎30min。將破碎液12 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.3.3 尿酸氧化酶酶活測定方法

將粗酶溶液0.1 mL與含有2 mmol/L尿酸的0.6 mL硼酸鈉緩沖液（pH8.5，0.1 mol/L）、0.15 mL 4-氨基安替比林（30 mmol/L）、0.1 mL苯酚（1.5%）、0.05 mL過氧化物酶（15 U/mL）加入到25 mL比色管中，25℃孵育10 min。然后通過加入1.0 mL乙醇停止反應(yīng)，去離子水定容至20 mL。空白對照：把粗酶液置換為硼酸鈉緩沖液。采用分光光度計測定波長540 nm處的吸光度值。

尿酸氧化酶酶活單位的定義：在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下，每min可產(chǎn)生1.0 μmol H2O2的酶量為一個酶活單位（U/mL）。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

（1）碳源、氮源優(yōu)化：分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入可溶性淀粉、尿酸、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖作為碳源，添加量為0.5%；分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、磷酸氫二銨、氯化銨、尿素作為氮源，添加量為3%。在25℃、160 r/min條件下培養(yǎng)36 h，按照酶活測定方法測定酶活，考察碳源、氮源對苛求芽孢桿菌Z7-1產(chǎn)尿酸氧化酶的影響。每個處理做3個平行。

（2）尿酸添加量分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%，酵母膏添加量分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%，K2HPO4添加量分別為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%；KH2PO4添加量分別為0.01、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%的；MgSO4添加量分別為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%，培養(yǎng)基初始pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，發(fā)酵溫度分別為10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，轉(zhuǎn)速分別為140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min、180 r/min，裝液量分別為50 mL/500 mL、75 mL/500 mL、100 mL/500 mL、125 mL/500 mL、150 mL/500 mL、175 mL/500 mL，接種量分別為3%、4%、5%、6%、7%。在25℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h后測定酶活，考察各個因素對苛求芽孢桿菌Z7-1產(chǎn)尿酸氧化酶的影響。每個處理做3個平行。

1.3.5 Plackett-Burman設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取9個影響因素作為研究對象，以尿酸氧化酶酶活（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗次數(shù)N=12的Plackett-Burman（PB）設(shè)計，PB試驗設(shè)計的因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.6 最陡爬坡試驗設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果中各個顯著影響因素效應(yīng)的大小來設(shè)定步長及變化方向，找出峰值，快速逼近最佳值區(qū)域。

1.3.7 中心組合試驗設(shè)計

根據(jù)最佳爬坡試驗結(jié)果，將酶活最高的一組作為中心組合試驗中心點，運用Minitab 15軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，采用響應(yīng)面分析法對產(chǎn)酶條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析。運用Minitab15軟件分析得到最優(yōu)結(jié)果，最后對預(yù)測值進(jìn)行驗證。每個試驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 最適碳源的確定

圖1 不同的碳源對酶活的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on enzyme activity

如圖1所示，尿酸作為唯一碳源時，菌株Z7-1產(chǎn)尿酸氧化酶的酶活最高，葡萄糖次之，可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖作為碳源時，酶活很低。因此，尿酸是菌株Z7-1產(chǎn)尿酸氧化酶的最適碳源。

2.1.2 尿酸添加量的確定

圖2 不同的尿酸添加量對酶活的影響Fig.2 Effects of different uric acid addition on enzyme activity

如圖2所示，尿酸添加量從0.25%升至1.25%，尿酸氧化酶的酶活隨著尿酸添加量的增加而增高，當(dāng)尿酸添加量達(dá)到1.00%時尿酸氧化酶的酶活最高。然而當(dāng)尿酸添加量＞1.00%之后，酶活反而下降，是因為尿酸難溶于水，尿酸濃度增加反而阻礙了菌株Z7-1對尿酸的利用。因此，最適尿酸添加量為1.00%。

2.1.3 最適氮源的確定

圖3 不同的氮源對酶活的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on enzyme activity

如圖3所示，當(dāng)無機(jī)氮作為唯一氮源時，菌株Z7-1產(chǎn)酶酶活很低。而菌株利用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏時酶活很高。因此菌株Z7-1產(chǎn)酶是利用的有機(jī)氮。其中將酵母膏作為氮源時酶活最高。因此，選酵母膏為最適氮源。

2.1.4 酵母膏添加量的確定

圖4 酵母膏添加量對酶活的影響Fig.4 Effects of yeast extract addition on enzyme activity

如圖4所示，隨著酵母膏添加量在0.25%～0.75%范圍內(nèi)增加，菌株產(chǎn)酶酶活也隨之增高。當(dāng)酵母膏添加量達(dá)到0.75%時酶活最高。而酵母膏添加量過高時，酶活反而下降。說明濃度過高的酵母膏會對菌體生長有一定抑制作用，進(jìn)而影響尿酸氧化酶的合成，然而酵母膏添加量過低就會影響酶的大量合成[12]。因此，最適酵母膏添加量為0.75%。

2.1.5 無機(jī)鹽最適添加量的確定

如表2所示，當(dāng)K2HPO4添加量為0.25%時，尿酸氧化酶酶活最高，為16.1 U/mL；KH2PO4添加量0.07%時尿酸氧化酶酶活最高，為16.4 U/mL，說明適量KH2PO4和K2HPO4對該菌株產(chǎn)酶有促進(jìn)作用；MgSO4添加量0.05%時，尿酸氧化酶酶活最高，為15.8 U/mL；說明少量的硫酸鎂對該菌株產(chǎn)酶有促進(jìn)作用。

表2 無機(jī)鹽添加量對酶活的影響Table 2 Effects of inorganic salt addition on enzyme activity

2.1.6 發(fā)酵初始pH值對產(chǎn)酶的影響

如圖5所示，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為6.5～7.5時，菌株產(chǎn)酶酶活也隨之增高；當(dāng)發(fā)酵初始pH值為7.5時，酶活最高，為16.5 U/mL；當(dāng)發(fā)酵初始pH值＞7.5之后，酶活有所下降，過酸過堿都會影響菌株產(chǎn)酶。因此，最適發(fā)酵初始pH值為7.5。

圖5 初始pH值對酶活的影響Fig.5 Effects of initial pH value on enzyme activity

2.1.7 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

圖6 發(fā)酵溫度對酶活的影響Fig.6 Effects of fermentation temperature on enzyme activity

如圖6所示，當(dāng)發(fā)酵溫度為10～25℃時，菌株酶活也隨之增高；當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃時，發(fā)酵酶活最高，為17.5 U/mL；隨著發(fā)酵溫度＞25℃之后，酶活降低。因此，最適發(fā)酵溫度為25℃。

2.1.8 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

如圖7所示，酶活隨著轉(zhuǎn)速在140～160 r/min范圍內(nèi)的增加而增高；當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r/min時酶活最高，為17.8 U/mL；轉(zhuǎn)速＞160 r/min之后，酶活會隨之下降，過高的轉(zhuǎn)速可能影響了菌體的生長。因此，最適轉(zhuǎn)速為160 r/min。

圖7 轉(zhuǎn)速對酶活的影響Fig.7 Effects of rotating speed on enzyme activity

2.1.9 裝液量對產(chǎn)酶的影響

如圖8所示，在裝液量為（50～125）mL/500mL時，菌株Z7-1產(chǎn)尿酸氧化酶的酶活隨之增加；當(dāng)裝液量為125 mL/500 mL時，酶活最大，為17.9 U/mL；當(dāng)裝液量＞125 mL/500 mL之后，酶活隨之下降。裝液量影響酶活，主要是影響菌株對溶氧的需求。裝液量為125 mL/500 mL時，能達(dá)到菌株對溶氧的需求，促進(jìn)了菌株的生長，進(jìn)而促進(jìn)了菌株產(chǎn)酶。因此，最適裝液量為125 mL/500 mL。

圖8 裝液量對酶活的影響Fig.8 Effects of liquid volume on enzyme activity

2.1.10 接種量對產(chǎn)酶的影響

如圖9所示，當(dāng)接種量為3.0%～5.0%時，菌株產(chǎn)尿酸氧化酶隨接種量增大而升高；當(dāng)接種量為5%時，酶活達(dá)到最大，為17.6 U/mL；當(dāng)接種量＞5.0%之后，酶活反而下降。這是因為培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)是有限的，培養(yǎng)基中菌體數(shù)目過多也會影響菌株的生長，進(jìn)而影響菌株產(chǎn)酶。因此，最佳接種量為5.0%。

圖9 接種量對酶活的影響Fig.9 Effects of inoculum on enzyme activity

2.2 Plackett-Burman設(shè)計篩選顯著因子[13-15]

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計Plackett-Burman（N=12）實驗，對影響尿酸氧化酶發(fā)酵工藝中的9個因素的顯著性進(jìn)行考察。試驗的設(shè)計及結(jié)果見表3，利用Minitab15軟件進(jìn)行主效應(yīng)分析，結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman設(shè)計的各因素水平及主效應(yīng)分析Table 4 Factors,levels and significance analysis of Plackett-Burman design

由表4中的P值可知，尿酸、發(fā)酵溫度、酵母膏的P值分別為0.004、0.005、0.028，由于這三個因素的P值均＜0.05，所以這3個因素對試驗結(jié)果的影響均＞95%，達(dá)到顯著水平，在所選因素中對試驗結(jié)果影響最大，其中尿酸、發(fā)酵溫度具有正效應(yīng)，酵母膏具有負(fù)效應(yīng)。因此選尿酸添加量、酵母膏添加量、發(fā)酵溫度設(shè)計響應(yīng)面試驗。

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是為了確定顯著影響因素的取值逼近中心點以及提高尿酸氧化酶的產(chǎn)量，尿酸添加量、發(fā)酵溫度和酵母膏添加量這3個因素的變化方向和步長的試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。由表5可知，3個顯著影響因素的中心點在第2組試驗附近，因此確定以第2組的水平作為響應(yīng)面試驗的中心點，即尿酸添加量（X1）、酵母膏添加量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）分別為1.00%，0.75%和25℃。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

利用上述Plackett-Burman試驗結(jié)果，在PB試驗和最陡爬坡試驗確定的3因素3水平的基礎(chǔ)上，以酶活（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗因素與水平見表6，設(shè)計及結(jié)果見表7。

表6 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 6 Factors and levels of response surface experiments

表7 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments

表8 回歸方程方差分析Table 8 Variance analysis of the quadratic model

運用Minitab15軟件對表7中心組合試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型方差分析，結(jié)果見表8。回歸擬合二次多項式得到回歸方程：Y=45.53+2.80X1+2.25X2+3.45X3-0.48X1X2+1.28X1X3-

由表8可知，該回歸模型的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），失擬項P值為0.106＞0.05，因而無失擬因素存在。其自變量X1，X2，X3，X2X3，X32對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），其他項均不顯著（P＞0.05）。回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9661＞0.9，校正決定系數(shù)R2Adj為0.951 2＞0.9，表明響應(yīng)值變化有96.61%來源于所選變量，說明模型擬合度較好，該回歸方程可用于代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行初步分析和預(yù)測[16-18]。

利用Minitab15軟件繪制響應(yīng)面曲線圖，結(jié)果見圖10。由圖10可知，響應(yīng)值存在最大值，經(jīng)軟件分析獲得酶活發(fā)酵條件為尿酸添加量1.14%，酵母膏添加量0.81%，發(fā)酵溫度28.1℃，軟件分析預(yù)測最大酶活為45.6 U/mL。為了便于實際操作，將發(fā)酵條件修改為尿酸添加量1.00%，酵母膏添加量0.80%，發(fā)酵溫度28℃，在此條件下重復(fù)3次驗證試驗，平均酶活為42.5 U/mL，與理論值接近，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳條件準(zhǔn)確可靠。優(yōu)化后的酶活比優(yōu)化前的12.1 U/mL提高了251.8%。

圖10 發(fā)酵溫度與尿酸，酵母膏添加量對酶活交互影響的曲面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,uric acid and yeast extract addition on enzyme activity

3 結(jié)論

本試驗對苛求芽孢桿菌（Bacillus fastidiosus）Z7-1產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上采用Mintab軟件設(shè)計Plackett-Burman試驗得出尿酸、酵母膏、發(fā)酵溫度3個最重要影響因素；利用Box-Behnken模型對菌株Z7-1發(fā)酵生產(chǎn)尿酸氧化酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，方差分析后表明模型擬合度良好。單因素及響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為尿酸添加量1.00%、酵母膏添加量0.80%、K2HPO4添加量0.25%、MgSO4添加量0.05%、KH2PO4添加量0.07%、培養(yǎng)溫度28℃、轉(zhuǎn)速160r/min、接種量5%、pH7.5、裝液量125mL/500mL。通過產(chǎn)酶條件優(yōu)化尿酸氧化酶酶活由優(yōu)化前的約12.1U/mL提高到42.57U/mL，比優(yōu)化前提高了251.8%。

苛求芽孢桿菌Z7-1最適生長溫度為25℃，該菌株屬于耐冷菌，發(fā)酵粗酶液最適作用溫度為25℃，屬于低溫酶。海洋環(huán)境低溫、高鹽、高壓，菌株Z7-1與其他國內(nèi)外篩選的尿酸氧化酶酶菌株相比[4]，具有適應(yīng)低溫環(huán)境（25℃），耐鹽性極好，耐高壓等優(yōu)良特征。海洋尿酸氧化酶對催化尿酸嘌呤環(huán)的氧化開放的性質(zhì)、臨床分析和臨床藥物以及染發(fā)劑商業(yè)配方中的添加劑的制備更具有優(yōu)勢。因此，對該菌株發(fā)酵條件的研究，可為其進(jìn)一步發(fā)酵放大乃至工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。