醬香大曲中3株放線菌的分離篩選及揮發性成分分析

羅小葉，王曉丹，邱樹毅*

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

醬香大曲是一種高溫大曲，通過傳統固態發酵的方法，在65℃條件下，用小麥加母曲經過60 d的發酵自然形成的一個含有多種微生物體系的發酵制品[1-3]。多種微生物富集在大曲里在制曲過程中自然生長起來，整個大曲微生物復雜而多樣。目前采用純培養技術及分子生物學手段對茅臺大曲中的細菌、霉菌及酵母進行了深入的研究，證實了細菌的生香動力、霉菌的糖化主力以及酵母的酒醅發酵原動力的作用，詮釋了大曲中微生物在大曲酒的品質及風味呈現方面的重要作用[4-6]。

在大曲中“菌系”中的放線菌是一類具有高鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量的革蘭氏陽性細菌，其因產生豐富的活性次生代謝產物而著名，是一種重要的微生物類群。對于傳統白酒生產領域有關放線菌研究，主要集中在白酒發酵過程中酒醅、大曲、窖泥、發酵池、曲房和窖房空氣中放線菌的分離及鑒定，如崔福來等[7-9]對酒醅中的放線菌進行分離篩選研究。并有少量文獻如王濤等[10-11]對釀造相關的放線菌揮發性物質及代謝酶活性進行了研究報道。放線菌作為抗生素的主要生產菌種，在其他領域的研究較為深入，但作為白酒釀造的四大菌類之一，放線菌某些獨特代謝產物具有土味等特征，對白酒風味的影響不可忽視[12]，在白酒釀造過程中影響著酒體的風味、風格，相對于其他三大類微生物，還沒被引起足夠的重視。目前，研究人員僅對醬香大曲生產過程中周圍土壤及糟醅中的放線菌進行了研究，對醬香大曲中放線菌的種類及功能鮮有研究報道。

本研究旨在建立了一種有效的放線菌分離篩選方法，通過形態學、生理生化及26S rDNA分子生物學對篩選的放線菌進行了鑒定，并采用大曲酶系酶活力測定方法對其酶活性質及通過固態微萃取與氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術對發酵代謝產物成分進行了分析，為了解放線菌在醬香大曲中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醬香大曲來源于貴州茅臺鎮某醬香型白酒企業車間生產用高溫大曲，大曲樣品為已經在車間貯存半年且準備用于生產的已經粉碎至20目的曲粉，在混合好的曲粉袋中按上、中、下層分別隨機取20個樣品，再經過充分混合后，迅速放入無菌保鮮袋中，于4℃冰箱中保存備用。

1.1.2 試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒：美國BIOMIGA公司；萘啶酮酸、制霉菌素：上海源葉生物科技有限公司；新生霉素：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均國產分析純。

1.1.3 培養基

分離培養基采用高氏一號培養基（M1）、國際鏈霉菌計劃（international streptomyces project，ISP）指定的鏈霉菌固體培養基ISP2（M2）、ISP3培養基（M3）、ISP4培養基（M4）、ISP5培養基（M5）、R2A培養基（M6）、淀粉-甘油培養基（M7）、GYM培養基（M8）、GTY培養基（M9）、HV培養基（M10）。上述培養基均自配，121℃滅菌20 min。

純化及菌種保藏培養基采用ISP2培養基：酵母提取物4 g，麥芽提取物1 g，葡萄糖4 g及瓊脂15 g，用1 L蒸餾水溶解，然后用5 mol/L NaOH溶液調pH值為7.3，121℃滅菌20 min。

液體發酵培養基：葡萄糖10 g、酵母膏4 g、蛋白胨4 g、酵母浸粉4 g、K2HPO44 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，用1L蒸餾水溶解，然后用5mol/LNaOH溶液調pH值為7.2～7.4，然后121℃滅菌20 min。

生理生化實驗培養基：明膠培養基、淀粉瓊脂培養基、硝酸鹽液體培養基、纖維素分解培養基。

酶活力測定培養基采用麩皮培養基：稱取麩皮15 g，用15 mL蒸餾水攪拌均勻，然后121℃滅菌20 min。

固態發酵產香培養基：將粉碎的高粱與未粉碎的高粱按3∶1（g∶g）進行混合，然后將混合的高粱與粉碎的小麥按1∶1（g∶g）進行混合，加入40%的水混合均勻，潤糧24h后用瓶進行分裝（50g/瓶），用8層紗布進行封口，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設備

庫爾特BECKMAN離心機：美國貝克曼庫爾特中國有限公司；Flex cycler多功能PCR儀：德國耶拿分析儀器股份公司；DYCP44P電泳儀：北京欣惠澤奧科技有限公司；ZF25凝膠成像儀：上海方畦儀器有限公司；S3400N掃描電鏡：日本日立有限公司；FD-1C-80冷凍干燥機：上海喬躍電子有限公司；HP6890/5975C氣質聯用儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 篩選方法

（1）樣品預處理

干熱處理（a1）：用滅菌的燒杯稱取10 g茅臺大曲樣品，然后將燒杯封口并置于100℃烘箱中加熱1 h；最后將大曲樣品放入含有90 mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩培養30 min備用；

濕熱處理（a2）：稱取10 g茅臺大曲樣品放入含有90 mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，在50℃恒溫水浴鍋中熱處理10 min，再振蕩培養30 min備用；

先干熱后濕熱處理（a3）：用滅菌的燒杯稱取10 g茅臺大曲樣品，然后將燒杯封口并置于100℃烘箱中加熱1 h，再將大曲樣品放入含有90 mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角瓶中，在50℃恒溫水浴鍋中熱處理10 min，最后振蕩培養30 min備用；

CaCO3富集培養（a4）：按照大曲樣品與CaCO3為10∶1（g∶g）的比例在無菌燒杯中混合，添加適量無菌水，在濕度為30%、溫度為28℃的培養箱中培養7 d，然后放入含有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中振蕩培養30 min后備用；

先CaCO3富集培養后再進行濕熱處理（a5）：在a4處理基礎上在振蕩培養之前將三角瓶放在50℃恒溫水浴鍋中熱處理10 min，再振蕩培養30 min備用。

（2）分離培養基的選擇

在28℃條件下，比較5種預處理方法的樣品在10種分離培養基上的生長狀況。

（3）稀釋液的篩選

分別選擇無菌生理鹽水（質量濃度為9 g/L）及羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）水溶液（質量濃度為2.5 g/L）作為稀釋液[13]。

（4）抑制劑的添加

表1 抑制劑的添加組合Table 1 Addition combinations of inhibitors

用0.1 mol/L NaOH溶液將萘啶酮酸配制成質量濃度為50 mg/L（A1）、100 mg/L（A2）及150 mg/L（A3）的溶液；用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液將制霉菌素配制成質量濃度為20 mg/L（B1）、40 mg/L（B2）及60 mg/L（B3）的溶液；用無菌水將新生霉素配制成質量濃度為30 mg/L（C1）、40 mg/L（C2）及50 mg/L（C3）的溶液；用無菌水將重鉻酸鉀配制成質量濃度為25 mg/L（D1）、50 mg/L（D2）及75 mg/L（D3）的溶液。同時，抑制劑均用0.22 μm的無菌濾膜過濾，然后加入滅菌培養基中混勻，倒入培養皿中[14]。其中，抑制劑的添加組合如表1所示。

（5）分離涂布的方法

稱取10 g茅臺大曲樣品加入含有90 mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，將三角燒杯置于28℃、200r/min的恒溫水浴鍋中振蕩培養30 min。然后取1 mL上述樣品懸浮液進行10倍梯度稀釋，分別取0.2 mL各稀釋度菌懸液涂布于分離培養基上，將培養基置于28℃培養箱中倒置培養，并進行分離純化，分離得到的菌株用ISP2培養基斜面培養，并在4℃冰箱中保藏備用。

1.3.2 菌種的鑒定

（1）形態培養特征觀察

菌株的培養特征觀察參照ISP中有關放線菌的培養特征進行觀察[15]。

（2）掃描電鏡觀察

用液體培養基發酵培養48 h后，離心后棄上清，加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌菌體3次；向菌體沉淀中加入2.5%戊二醛固定液1.5 mL，4℃固定過夜；用體積分數30%、50%、70%、90%的叔丁醇/乙醇混合液進行脫水，每次5 min，再用100%叔丁醇脫水2次，每次5 min；然后冷凍干燥4 h，干燥后的粉末樣品鍍金膜，用掃描電鏡進行觀察[16-17]。

（3）生理生化特征鑒定

對放線菌進行明膠液化實驗、淀粉水解實驗、碳源利用實驗、纖維素分解實驗、硝酸鹽實驗及牛奶凝固與胨化實驗，并參照《鏈霉菌鑒定手冊》推薦的標準培養基和常用生理生化方法培養、觀察和記錄[14]。

（4）分子生物學鑒定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，以F（5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）及R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3'）為引物進行聚合酶鏈反應（polymerasechain reaction，PCR）擴增，PCR擴增程序為94℃預變性5 min，然后94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30個循環，最后72℃延伸9 min；取2 μLPCR產物用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA提取效果；PCR產物在上海立菲生物工程技術服務有限公司進行測序；將測序數據在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI）數據庫中進行同源序列搜索，用MEGA5.05軟件進行多序列比對，然后用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.3.3 放線菌粗酶液的制備及酶活力的測定

（1）粗酶液的制備

用接菌環取兩環活化的菌株接種到液體發酵培養基中，28℃培養48 h，然后以10%的接種量接種到麩皮培養基中，再28 ℃培養5 d，所得培養物與水按照1∶10（g∶mL）的比例混合攪勻，40℃水浴1 h，每隔15 min攪拌1次，最后進行過濾，所得濾液為粗酶液。

（2）酶活力的測定

糖化型淀粉酶與纖維素酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法；酸性蛋白酶活力的測定根據商業行業標準SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中的方法進行測定；脂肪酶活力的測定根據國標GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中的動態滴定法進行測定；果膠酶活力的測定根據輕工業行業標準QB1502—1992《食品添加劑——果膠酶制劑》中的方法進行測定。

糖化型淀粉酶酶活定義：在40℃、pH4.6條件下，1 h水解淀粉產生1 mg葡萄糖作為一個酶活力單位。纖維素酶酶活定義：50℃條件下，1 min催化纖維素水解成1 μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位。蛋白酶酶活定義：在40℃下1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。脂肪酶酶活定義：在40℃，pH7.5條件下，粗酶液1 min水解底物生成1 μmol可滴定的脂肪酸為一個酶活力單位。果膠酶酶活定義：在50℃、pH3.5的條件下，粗酶液1 h分解果膠產生l mg半乳糖醛酸為一個酶活單位。

1.3.4 放線菌固態發酵產物的香氣成分測定

放線菌固態發酵產物的香氣成分測定采用氣質聯用法。用接菌環取兩環活化的菌株接種到液體發酵培養基中，28℃培養48 h，以10%的接種量接入高粱與小麥固體發酵培養基中，28℃培養7 d。

氣相色譜條件：色譜柱為Zebron ZB-5MSI彈性石英毛細管柱（30 cm×0.25 mm×0.25 μm），柱溫為40℃，保留時間為2 min，以5℃/min升溫至270℃，運行時間為48 min，汽化室溫度為250℃，載氣為高純氦氣（He）（99.999%），載氣流量為1 mL/min，不分流進樣，溶劑延遲時間為1 min。

質譜條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，電子能量為70 eV，發射電流為34.6 μA，倍增器電壓為1 294 V；接口溫度為280℃，質量范圍為20～450 amu，用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 分離篩選條件的確定

5種預處理方法的樣品在10種分離培養基上，28℃條件下培養，培養結果表明在常溫條件下先干熱處理再濕熱處理能夠有效抑制分離平板上非目的菌主要是細菌的生長，大大促進分離平板上放線菌的生長。高氏一號培養基（M1）、ISP2培養基（M2）、淀粉-甘油培養基（M7）上均能生長出具有放線菌菌落形態特征的菌落，其余各培養基及各預處理方法均未見任何菌落生長。

2.2 放線菌的鑒定

從醬香大曲中分離純化出3株具有放線菌菌落形態特征菌株，本實驗室保藏編號分別為FBKL4.001、FBKL4.002、FBKL4.003。菌株進行形態學特征、生理生化實驗及分子生物學鑒定。

2.2.1 形態學特征

由3株菌單菌落形態及顯微鏡特征（圖1）可知，FBKL4.001菌落形狀缺刻狀圓形，基內菌絲淡黃色，氣生菌絲白色，菌落凸起、干燥致密，無可溶性色素產生；FBKL4.002菌落形狀缺刻狀圓形，基內菌絲淡灰色，氣生菌絲白色，菌落凸起、干燥致密，無可溶性色素產生；FBKL4.003菌落形狀橢圓形，基內菌絲淡黃色，氣生菌絲白色，菌落中間凸起半干燥，無可溶性色素產生。3株菌在顯微鏡下的特征結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》，FBKL4.001、FBKL4.002、FBKL4.003菌絲分散度好，相互交叉重疊，菌絲表面光滑飽滿，有明顯孢子鏈[15]，FBKL4.001和FBKL4.002的孢子鏈較為相似。

圖1 3株菌株的菌落形態及顯微鏡特征Fig.1 Colonial morphology and microscope features of 3 strains

2.2.2 生理生化特征

各菌株的生理生化試驗結果見表2。

表2 3株菌株的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical property of 3 strains

由表2可知，3株菌株能利用碳源范圍較廣，能利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、棉子糖等，FBKL4.003能使淀粉水解，但不能分解纖維素，明膠液化實驗中所有菌株使明膠液化，使牛奶胨化產酸。

2.2.3 分子生物學鑒定

以3株菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，其PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。

圖2 3株菌株16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification products of 3 strains

由圖2可知，3株菌株PCR擴增結果在400 bp處出現明顯條帶。基因序列測定后，測序結果在GenBank數據庫中進行同源序列搜索（BLAST search），用MEGA5.05軟件進行多序列比對，鄰接法構建系統發育樹如圖3。

圖3 菌株FBKL4.004的16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain FBKL4.004 based on 16S rDNA gene sequence

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》、《鏈霉菌鑒定手冊》，結合菌株形態、生理生化特征及分子生物學比對分析，FBKL4.001、FBKL4.002鑒定為可可鏈霉菌（Streptomyces cacaoi）；FBKL4.003為沙阿霉素鏈霉菌（Streptomyces zaomyceticus）。Streptomyces cacaoi最先是從尼日利亞發霉的可可豆發現的，后來從海洋沉積物中也能分離到，且該菌一些代謝產物可提供有治療價值的先導化合物，其變種發酵產生多氧霉素B（polyoxin B）[18]，抗生素KA08[19-20]。Streptomyces zaomyceticus最先是從日本的沙阿山（Mt.Zao）的土壤中分離到，可產生一種新的雙功能酶幾丁質酶并應用在殼寡糖抗氧化劑生產中[21-22]。

2.3 放線菌的產酶特性

表3 3株菌株酶活力測定結果Table 3 Determination results of enzymatic activity of 3 strains

由表3可看出，各種酶的酶活力差異較大，菌株FBKL4.001、FBKL4.002、FBKL4.003的果膠酶活力均為最高，FBKL4.001和FBKL4.003所產果膠酶均高于醬香大曲細菌所產果膠酶最高酶活（259 U/g）和霉菌所產果膠酶最高酶活（260 U/g）[23]，表明放線菌也能產生酶活力水平相對較高的果膠酶；其次是糖化酶活力，但3株菌糖化酶酶活均低于細菌和霉菌所產果膠酶酶活。其中菌株FBKL4003不產脂肪酶，3株菌剩余酶活種類的酶活力相對較弱，其中纖維素酶活力最弱，說明該3株放線菌對纖維素的分解能力比較弱。

2.4 放線菌固態發酵香氣成分分析

對從醬香大曲中分離得到的3株放線菌進行了固態發酵，并通過固態微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術對其揮發性成分組成及成分風味進行了測定，結果見圖4及表4。從圖4及表4可以看出，研究報道從釀造環境、土壤、空氣等分離出的放線菌固態發酵揮發性成分分析主要以萜烯類物質為主[10-11]，而從大曲中分離得到的菌株FBKL4.001固態發酵揮發性成分組成看出，代謝產物種類豐富，主要以酯類物質為主，占62.80%，其次包括13.86%醇類、6.17%萜烯類物質，此外該菌還能代謝產生5.39%吡嗪類物質。菌株FBKL4.003揮發性成分組成與菌株FBKL4.001相似，主要以酯類物質為主，占46.77%，其次萜烯類物質占23%，也能產生4.49%吡嗪類物質，此外能產生少量酮類、醛類、酚類等代謝產物。

圖4 3株菌株固態發酵產物揮發性成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ions chromatogram of the volatile components of solid-state fermentation products of 3 strains

表4 3株菌株揮發性成分組成分析Table 4 Composition analysis of volatile components produced by 3 strains

3 結論

本研究建立了一種有效的分離放線菌的方法，從醬香大曲中分離篩選出3株放線菌，其中FBKL4.001、FBKL4.002為可可鏈霉菌（Streptomyces cacaoi）、FBKL4.003為沙阿霉素鏈霉菌（Streptomyces zaomyceticus）。通過對其酶活和固態發酵產物揮發性成分進行探討，發現放線菌產果膠酶較為突出，分別高達299.66 U/g、216.52 U/g、294.86U/g；同時，通過對其固態發酵揮發性成分進行分析，發現酯類物質含量最高，分別占62.80%、59.23%、46.77%；均能代謝產生吡嗪類物質，此外能產生少量酮類、醛類、酚類等物質。本研究為發現固態發酵更多的微生物資源及其在白酒發酵生產中的作用及應用奠定了基礎。