產脂肪酶重組菌SRI-01隨機突變及誘導表達條件的研究

尹金鳳，李泓全，吳欣森*

（上海化工研究院有限公司，上海 200062）

脂肪酶（EC3.1.1.3 lipase）又稱為三酰基甘油酯水解酶，是一種非常重要的酯鍵水解酶[1]，在醫藥、食品、皮革和洗滌劑等[2-4]工業領域中應用廣泛。近年來，隨著異相系統酶學和非水相酶學的發展，脂肪酶在手性化合物光學拆分等醫藥中間體合成領域也顯示了巨大的潛力[5-7]。相較于化學合成，酶法合成具有條件溫和，底物專一性強，產物純度高等優點[8]，酶法拆分的優勢日趨明顯。

脂肪酶廣泛存在于微生物、植物和動物組織中，尤其是各種微生物，如細菌、放線菌、酵母等[9-10]。粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）能夠產生胞外脂肪酶[11]，可以用于地爾硫卓醫藥中間體（±）-對甲氧基苯基縮水甘油酸甲酯（methyl2R，3S-（-）-3-（4-methoxyphenyl）oxiranecarboxylate，（±）MPGM）酶法拆分[12-13]，但是目前其產生的胞外脂肪酶活性較低。LIXY等[14]從λ噬菌體基因文庫中克隆了S.marcescens SM6編碼脂肪酶的基因，并在JM109（DE3）中獲得了表達，但是表達量只達到野生菌的水平，大多為失活的包涵體；LONG Z D等[15]利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的方法克隆了S.marcescensECU1010的脂肪酶基因，同時在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中獲得了表達，在培養條件和培養基優化后，脂肪酶活性達到5 000～6 000 U/L，但是可溶的活性酶蛋白僅占30%。

傳統隨機突變文庫構建過程復雜，涉及雙酶切、回收、連接和轉化等多個步驟，效率低下，大引物全質粒法（megaprimer PCR of whole plasmid，MEGAWHOP）法[16-17]通過兩步PCR即可獲得突變體文庫，省去了脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）純化步驟，是一種比較快速有效的隨機突變方法[18]。但由于MEGAWHOP法以隨機突變后的目標基因作為雙鏈互補的引物對（Megaprimers），所用的特大引物必須針對目標基因及易錯條件特別制備，故MEGAWHOP法一般適用于500～1 000 bp大小的目的基因的隨機突變[17]，隨著引物對長度的增加，MEGAWHOP法PCR擴增難度也隨之增大，PCR產物獲得率明顯下降。為進一步豐富脂肪酶基因（lipA，大小1 845 bp）庫，獲得更高活力的脂肪酶重組菌株，本實驗室擬首先通過常規分子生物學手段[19]，實現將粘質沙雷氏菌（S.marcescensCGMCC14850）來源的脂肪酶基因sm-lipA在大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）中成功表達，采用MEGAWHOP法隨機突變大腸桿菌脂肪酶重組菌株，構建突變文庫，獲得優勢突變株，并對突變菌株的誘導條件[20-22]及可溶蛋白的釋放進行了相關研究，以期獲得高產脂肪酶的突變株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC14850：本實驗室保藏；大腸桿菌（Escherichiacoli）BL21和DH5α：北京康為世紀生物科技有限公司；質粒pET32a（+）：生物風公司。

1.1.2 試劑

DNAMarker、DNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖、Goldview、TaqDNA聚合酶（5U/mL）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG）、DpnⅠ限制性內切酶（10 U/μL）：上海生工生物工程有限公司；PCR引物合成及測序委托上海生工生物工程有限公司；pfu DNA聚合酶（25 U/μL）：上海浩然生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 培養基

Luria-Bertan（LB）液體培養基：胰蛋白胨1%、酵母膏0.5%、NaCl 1%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

LB液體培養基/氨芐青霉素（ampicillin，Amp）瓊脂平板：在LB液體培養基中加入瓊脂2%，121℃滅菌20 min，終質量濃度100μg/mL的氨芐青霉素。

1.2 儀器與設備

UV755B紫外分光光度計：上海分析儀器廠；JY92-Ⅱ超聲波破碎儀：寧波新芝科學儀器所；CSB-2潔凈工作臺：上海凈化設備廠；HYG-Ⅱ回轉恒溫調速搖瓶柜：上海新星自控設備廠；T100 PCR儀：美國BIO-RAD公司；BG-T0520全自動凝膠成像儀：北京百晶生物技術有限公司；FD201穩流穩壓電泳儀：上海醫用分析廠；GHP-9080N隔水式培養箱：上海一恒科技有限公司；PL2002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；THD-0506低溫恒溫槽：寧波天恒儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶重組菌株SRI-01的分子構建

參照文獻[19]中的常規分子構建方法，按照美國國家生物技術信息中心（nationalcenterofbiotechnologyinformation，NCBI）數據庫中脂肪酶lipA的核酸序列設計對應引物：上游引物5'-CGCGGATCCATGGGCATCTTTAGCTATAAG-3'（10 μmol/L）和下游引物5'-CCCAAGCTTTTAGGCCAA CACCACCTGAT-3'（10 μmol/L），對來源于沙雷氏菌S.marcescensCGMCC 14850的脂肪酶基因進行分子克隆，并將擴增得到的目的片段和pET-32a（+）質粒進行雙酶切反應（BamHI-HindIII組合），雙酶切產物純化后進行連接和轉化，挑取陽性轉化子進行驗證。對陽性轉化子進行發酵，測定脂肪酶活性。將此重組菌株命名為SRI-01。

1.3.2 隨機突變法改造重組菌株SRI-01

易錯PCR（error-pronepolymerasechainreaction，ep-PCR）建立隨機突變庫：以重組菌株SRI-01質粒為模板，上游引物5'-CGCGGATCCATGGGCATCTTTAGCTATAAG-3'（10 μmol/L）和下游引物5'-CCCAAGCTTTTAGGCCAA CA CCACCTGAT-3'（10μmol/L）分別為上下游引物進行50 μL體系的易錯PCR隨機突變庫擴增，并設置錳離子Mn2+濃度梯度（0.05mmol/L、0.10mmol/L、0.15mmol/L、0.20mmol/L、0.30 mmol/L）控制突變庫頻率。

以純化后的ep-PCR擴增產物為Megaprimer，重組菌株SRI-01質粒（pET32a-LipA，7 745 bp）為模板，參照MEGAWHOP[16]法進行全質粒PCR擴增，將LipA基因的ep-PCR產物Megaprimer直接擴增至pET32a表達載體；在MEGAWHOP法擴增的PCR產物中加入DpnⅠ限制性內切酶，專一性消化甲基化序列GATC，37℃條件下水浴反應2 h徹底降解原始模板；轉化至大腸桿菌BL21（DE3），涂布于LB培養基/氨芐青霉素瓊脂平板，直至轉化子形成。

96孔板高通量篩選隨機突變庫：采用欒政嬌[23]建立的96孔板高通量篩選模型對隨機突變庫進行篩選。

1.3.3 脂肪酶活力測定

脂肪酶活力的測定按照文獻[13]方法進行。移取100μL酶液，加入2.87 mL磷酸鉀緩沖液中（100 mmol/L，pH 7.5），30℃預保溫3min后，加入30 μL對硝基苯酚乙酸酯（p-nitrophenyl acetate，pNPA）的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液（100 mmol/L），使其終濃度為1 mmol/L，于波長405 nm處測定對硝基苯酚吸光度值的增長速率。

脂肪酶活力的定義：在上述反應條件下，每分鐘生成1.0 μmol對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）所需要的酶量，定義為一個酶活力單位（U）。

相對酶活：以最高酶活力為100%，其他與之相對百分比值為相對酶活。

1.3.4 脂肪酶突變菌株誘導條件優化

誘導前的菌體生物量的確定：將突變優勢菌株取5 μL菌液接種至LB/Amp培養基，培養12 h，再轉接至LB液體培養基（添加100 μg/mL Amp）中，37℃、180 r/min振蕩培養1.50 h、1.75 h、2.00 h、2.25 h、2.50 h、2.75 h、3.00 h、3.25 h，進行IPTG（0.1 mmol/L）誘導，同時加入CaCl2（3 mmol/L），16℃、180 r/min培養24 h，收集細胞，濃縮重懸，進行超聲波破碎，離心得到上清液，波長405 nm處測定吸光度值，得到相對酶活。

誘導劑IPTG濃度和CaCl2濃度的優化：將突變優勢菌株取5 μL菌液接種至LB/Amp培養基，培養12 h，再轉接至LB培養基（添加100 μg/mL Amp）中，37 ℃、180 r/min培養一段時間，進行IPTG誘導，同時加入CaCl2，考察條件：誘導劑IPTG終濃度：0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L、0.50mmol/L、1.00mmol/L；CaCl2終濃度：1mmol/L、2mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L。16℃、180 r/min誘導培養24 h，收集細胞，濃縮重懸，進行超聲波破碎，離心得到上清液，在波長405 nm處測定吸光度值，得到相對酶活。

脂肪酶突變菌株誘導溫度的優化：將突變優勢菌株取5 μL菌液接種至LB/Amp培養基，培養12 h，再轉接至LB培養基（添加100 μg/mL Amp）中，37℃、180 r/min培養一段時間，進行IPTG誘導，同時加入CaCl2，隨后分別置于12℃、16℃、20℃、25℃、30℃、37℃180r/min誘導培養24h，收集細胞，濃縮重懸，進行超聲波破碎，離心得到上清液，波長405 nm處測定吸光度值，得到相對酶活。

1.3.5 破碎緩沖液pH對突變菌株脂肪酶活力的影響

在誘導突變菌表達重組蛋白后，采用超聲波破碎細胞，采用冰浴，400 W，破2 s停6 s，99次，將破碎液10 500 r/min離心15 min，取上清液進行脂肪酶活力測定。考察超聲時不同pH破碎緩沖液對細胞破碎的效果，配制不同pH（6.5～9.0）的緩沖液（10mmol/L磷酸鈉緩沖體系下），分別測定突變株在對應pH條件下破碎的脂肪酶活力。

1.3.6 破碎緩沖液離子濃度對突變菌株脂肪酶活力的影響

在誘導突變菌表達重組蛋白后，采用超聲波破碎細胞，采用冰浴，400 W，破2 s停6 s，99次，將破碎液10 500 r/min離心15min，取上清液進行脂肪酶活力測定。考察超聲時不同破碎緩沖液離子對細胞破碎的效果，磷酸鉀緩沖液和磷酸鈉緩沖液的濃度分別為1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L，Tris-HCl緩沖液濃度為0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L，以純水作為空白對照，分別測定突變菌株在不同破碎緩沖液離子濃度條件下脂肪酶活性。

2 結果與分析

2.1 脂肪酶重組菌株SRI-01的分子構建

采用常規分子構建方法，從沙雷氏菌中提取脂肪酶目的基因片段，經過PCR擴增，將擴增產物進行電泳驗證（見圖1），與lipA基因大小吻合，為1 845 bp。隨后將目的基因與載體pET-32a（+）連接，轉化導入大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取陽性轉化子，對陽性轉化子提取質粒進行測序，測序結果與目標脂肪酶基因一致，將此陽性轉化子命名為SRI-01，通過對重組菌進行發酵驗證，測定脂肪酶活性為31 163 U/L。

圖1 沙雷氏菌脂肪酶基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳驗證Fig.1 Agarose gel electrophoresis validation of PCR amplification products of lipase genelipAfromSerratia marcescens

2.2 隨機突變法改造重組菌株SRI-01

2.2.1 易錯PCR建立隨機突變庫

以重組菌株SRI-01為模板，易錯PCR進行隨機突變擴增，設置0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.15 mmol/L、0.20 mmol/L、0.30mmol/LMn2+濃度梯度以控制突變庫頻率，如圖2A所示。

圖2 易錯PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳驗證Fig.2 Agarose gel electrophoresis validation of ep-PCR amplification products

由圖2A可知，隨著Mn2+濃度的升高，易錯PCR擴增效率也逐漸降低，當Mn2+濃度＞0.15 mmol/L時，ep-PCR產物未出現目的條帶（大小為1 845 bp），高濃度的Mn2+濃度可能抑制了TaqDNA聚合酶的活性[24]。

分別挑選0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L Mn2+濃度條件下獲得的克隆子進行測序，并測定具有脂肪酶活力的突變株所占比例。結果證明，0.1mmol/LMn2+濃度下的隨即突變擴增可以使脂肪酶的氨基酸序列產生1～3個突變，此濃度適于進一步的高通量篩選。故選用0.1 mmol/L Mn2+濃度條件下的PCR擴增產物進行MEGAWHOP法PCR擴增。

由于MEGAWHOP法一般適用于500～1 000 bp大小的基因隨機突變，片段過長將影響與質粒的連接效率，通過選用不同濃度配比的突變引物Megaprimer和質粒pET32a-LipA，最終在兩者濃度配比為0.5 μg∶0.05 μg時，獲得分子質量為7 745 bp的目標MEGAWHOP-PCR產物（見圖2B），其與理論值相符合。

2.2.2 96孔板高通量篩選重組菌株SRI-01隨機突變庫

采用96孔板高通量篩選，從2 300株突變文庫中獲得一株優勢突變株SRM08，進行核酸測序，結果見圖3。由圖3可知，突變株SRM08的脂肪酶基因核酸序列在原始重組菌SRI-01基礎上突變了兩個位點，即為SRM08（C510A/T530A）。但是氨基酸位點只突變了一個，177位的亮氨酸突變為谷氨酰胺。親水性的谷氨酰胺可能有助于脂肪酶活性的提高。

圖3 突變株SRM08與原始菌SRI-01脂肪酶核酸序列比對Fig.3 Aligment of nucleotide sequences of lipase from mutant strain SRM08 and original strain SRI-01

2.3 突變菌株SRM08誘導條件的研究

2.3.1 誘導前菌體生物量的確定

誘導前菌體生物量對突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響結果見圖4。

圖4 誘導前的生物量對突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響Fig.4 Effect of biomass before induction on lipase activity of mutant strain SRM08

由圖4可知，將突變菌株轉接至LB培養基中培養，分別取培養1.50～3.25 h后的菌體進行誘導，在對數期菌體生物量明顯增加。培養2.5 h，OD600nm值為0.7時進行誘導，獲得的突變株脂肪酶相對活力最高。此時的菌體生長迅速，代謝旺盛，有利于脂肪酶重組蛋白的表達。

2.3.2 誘導劑IPTG濃度和CaCl2濃度的優化

以原重組菌株SRI-01的誘導條件（IPTG：0.1mmol/L、鈣離子：3mmol/L）為參考依據，考察了不同添加濃度的誘導劑IPTG和鈣離子對突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響，結果見圖5。

圖5 IPTG（A）與CaCl2（B）的濃度對突變菌株SRM08脂肪酶活性的影響Fig.5 Effects of IPTG(A)and CaCl2(B)concentration on lipase activity of mutant strain SRM08

由圖5A可知，當IPTG添加濃度為0.1 mmol/L時，酶活力最高，即最佳濃度與原重組菌株相同，繼續提高IPTG濃度，酶活將顯著下降，這可能是由于高濃度的IPTG對菌株有一定的毒害作用[25]，采用較低濃度的IPTG可以適當地降低轉錄速率，有利于蛋白的可溶性表達[26]；同時，由于鈣離子作為脂肪酶的活性中心[27]，也會對酶活性產生一定影響。由圖5B可知，通過考察不同濃度鈣離子的添加對酶活性的影響，隨著鈣離子濃度升高，酶活逐漸提高，當CaCl2濃度為4 mmol/L時，酶活最高，原重組菌株最適的3 mmol/L條件僅為最高酶活的69.1%，這可能是由于突變菌對鈣離子的結合能力有所提高。

2.3.3 誘導溫度的優化

誘導溫度不僅影響菌體的生長，同樣影響重組蛋白的誘導表達和蛋白的可溶性[28]。誘導溫度對突變菌株SRM08脂肪酶活性的影響見圖6。

圖6 誘導溫度對突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響Fig.6 Effect of induced temperature on lipase activity of mutant strain SRM08

由圖6可知，在誘導溫度12～20℃時，脂肪酶活力保持穩定，在25℃的誘導溫度時，酶活大大提高，隨后酶活又隨著溫度升高逐漸下降，37℃誘導的酶活僅為最高值的28.7%，包涵體逐漸增多。因此，選擇25℃作為突變株重組脂肪酶的最適誘導溫度。

2.4 破碎緩沖液pH對突變株SRM08脂肪酶活力的影響

圖7 緩沖液pH值對突變菌株SRM08脂肪酶活性的影響Fig.7 Effect of pH value of buffer on lipase activity of mutant strain SRM08

由于pH對脂肪酶的穩定性有一定的影響，考察破碎過程中緩沖液的pH對脂肪酶可溶蛋白的影響是十分必要的。由圖7所示，pH 7.0時脂肪酶相對酶活最高，在pH 7.0～9.0時，酶活隨著pH上升逐漸下降，pH 8.0時保留72.3%的相對酶活，pH 9.0時保留61.5%的相對酶活，在偏堿性環境下，脂肪酶重組蛋白破壁時相對穩定；但是在pH6.5時僅保留25.4%的相對酶活，說明此酶對酸性條件極為敏感。因此，最適pH值為7.0。

2.5 破碎緩沖液離子濃度對突變株SRM08脂肪酶活力的影響

考察了不同濃度磷酸鉀緩沖液、磷酸鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液對重組脂肪酶活性影響，結果如圖8、圖9所示。

圖8 不同濃度的磷酸鉀緩沖液和磷酸鈉緩沖液對突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響Fig.8 Effects of different concentrations of potassium phosphate and sodium phosphate buffer on lipase activity of mutant strain SRM08

圖9 不同濃度Tris-HCl緩沖液對突變菌株SRM08脂肪酶活性的影響Fig.9 Effects of different concentrations of Tris-HCl buffer on lipase activity of mutant strain SRM08

由圖8、圖9可知，磷酸鈉緩沖液測定的脂肪酶活性為最高，磷酸鉀緩沖液和Tris-HCl緩沖液酶活數值相近。超聲破碎后進行離心，離子濃度高的緩沖液中沉淀較多，脂肪酶酶活相對較低；隨著破碎液離子濃度下降，包涵體沉淀逐漸減少，脂肪酶活性逐漸提高。其中磷酸鈉緩沖液的破碎條件下脂肪酶活性最高為88 508 U/L，實驗發現低濃度的磷酸鈉緩沖液破碎效果普遍好于磷酸鉀緩沖液，可能是由于高濃度的鉀離子抑制的酶活性。

3 結論

MEGAWHOP法隨機突變相較于傳統的隨機突變方法，更加簡單高效。但是基因片段過長，連接至載體上的效率也更低，本研究成功實現了將脂肪酶基因（1 845 bp）利用此法進行隨機突變，建立了隨機突變庫，并從中獲得了優勢菌株SRM08。

通過對優勢突變株SRM08進行誘導條件優化，突變株誘導前的菌體生物量OD600nm值為0.7（培養時間2.5 h），誘導溫度25℃時，IPTG的添加量為0.1 mmol/L，CaCl2濃度為4 mmol/L為最優誘導條件。采用5 mmol/L、pH 7.0磷酸鈉緩沖液有利于脂肪酶可溶蛋白的釋放。通過對隨機突變獲得的優勢突變株SRM08的誘導表達條件進行優化，最終產脂肪酶能力可達到88 508 U/L。

優質穩定的脂肪酶高效表達基因工程菌是獲得脂肪酶工業化生產的重要前提。構建脂肪酶基因突變文庫，提高基因工程菌的脂肪酶活力，為后續酶拆分反應提供高效的底物特異性脂肪酶，更加有利于縮短拆分反應時間，降低反應成本，為酶-化學法拆分（±）MPGM）的工業化應用奠定了基礎。