硫酸二乙酯化學(xué)誘變選育高核糖核酸釀酒酵母及培養(yǎng)基組成優(yōu)化

倪曉豐，趙 賓，王東旭，彭偉林，陳葉福，肖冬光，郭學(xué)武*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.深圳市福田區(qū)彩田學(xué)校，廣東 深圳 518036）

核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）簡稱核酸，是生物體內(nèi)重要的一類高分子化合物，也是生物體的基本組成成分之一[1]。核酸類物質(zhì)及其降解產(chǎn)物在遺傳工程、醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域有著廣泛的用途[2]。呈味核苷酸（5'-鳥苷酸和5'-肌苷酸）作為鮮味劑與氨基酸按一定比例混合使用時(shí)可使氨基酸的鮮味成倍增加[3]。其次，核酸降解產(chǎn)物三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是一種有效的心肌梗塞搶救藥物，也可以用于冠心病的預(yù)防[4]。另外，核酸還可以直接作為保健品，能夠有效提高機(jī)體的免疫力。

核酸的來源較為廣泛，其中從酵母中提取RNA最為常見，也是近年來研究的熱點(diǎn)。普通酵母菌中RNA含量約為6%～8%，脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）含量不超過0.3%，而高核酸酵母則是指核酸含量為12%～14%的酵母菌[5]。在自然界中，RNA含量高的酵母菌多屬于假絲酵母（Candida）[6]。之前關(guān)于高核酸酵母菌株的選育多集中在假絲酵母屬[7-8]。林忠等[9]通過使用高密度發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵解脂假絲酵母（Candida lipolytica），在最適pH和溶氧條件下采用pH-stat補(bǔ)糖分批發(fā)酵，最高核酸含量達(dá)到14.2%，最高菌體質(zhì)量濃度達(dá)到35.6g/L。普為民等[10]通過紫外-氟尿嘧啶復(fù)合誘變篩選到一株產(chǎn)朊假絲酵母（C.utilis），核酸含量達(dá)到了14.75%。但是，假絲酵母并不是通常被認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）的菌株，因此，近年來隨著對食品安全性的考慮，越來越多的研究集中在選育高核酸釀酒酵母的工作方面[11-13]。楊依順等[14]利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的氯化鉀敏感性，通過硫酸二乙酯化學(xué)誘變，篩選到一株釀酒酵母，RNA含量提高了25%，其RNA含量達(dá)到6.05%。俞燦等[15]利用釀酒酵母為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變選育，篩選出一株釀酒酵母，RNA含量提高了10.62%，其RNA含量達(dá)到8.11%。但是，前面的研究所篩選的酵母的核酸含量仍低于假絲酵母屬的酵母的核酸含量，因此，若想實(shí)現(xiàn)采用釀酒酵母工業(yè)化生產(chǎn)核酸，還需進(jìn)一步提高釀酒酵母的核酸含量。

在工業(yè)化生產(chǎn)中，首先，酵母的培養(yǎng)大多主要利用廢糖蜜培養(yǎng)基，因糖蜜含糖量高、且糖蜜自身大部分糖類為酵母可發(fā)酵利用的糖類，如蔗糖和還原糖，同時(shí)其自身還含有酵母生長所必需的礦物質(zhì)（鉀、氯、鈉、鎂等）和維生素。其次，糖蜜主要是蔗糖廠生產(chǎn)蔗糖的副產(chǎn)物，產(chǎn)量很高，而且價(jià)格低廉，是一種工業(yè)生產(chǎn)酵母理想的碳源[3，16-17]。

因此，本研究主要通過對釀酒酵母BY23進(jìn)行硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）化學(xué)誘變，篩選到一株胞內(nèi)RNA含量較高的突變株BY23-195。其后，以糖蜜作為碳源，通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基的配方，提高菌株BY23-195胞內(nèi)的RNA含量。BY23是一株工業(yè)化菌株，這在一定程度上為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)核酸奠定了理論基礎(chǔ)和提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

DES（分析純）：美國Sigma公司；酵母提取物：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨：山東玉寶生物科技有限公司；葡萄糖、高氯酸等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY23：由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院現(xiàn)代釀造實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏；所有突變菌株由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院現(xiàn)代釀造實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂2%。

糖蜜培養(yǎng)基：糖蜜（糖度調(diào)至12°Bx），酵母浸粉0.5%，硫酸銨0.05%。

以上3種培養(yǎng)基，自然pH值，121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary8454型紫外-可見分光光度計(jì)：美國安捷倫科技有限公司；D-37520型離心冷凍機(jī)：Eppendorf中國有限公司；LDZM-60KCS型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HWS-28型恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 化學(xué)誘變及高產(chǎn)核酸釀酒酵母的篩選

菌株活化：利用接種環(huán)從斜面上挑取一環(huán)菌泥接種于裝有YEPD培養(yǎng)基的試管中，于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

化學(xué)誘變：取培養(yǎng)至對數(shù)生長中期的S.cerevisiaeBY23菌懸液100 mL于250 mL三角瓶中，分別加入總體積的0、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的DES（5%（V/V）），于30℃、180r/min條件下振蕩處理30min，取1.0mL處理液迅速加入1.0 mL 25%（V/V）的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。在10-4稀釋倍數(shù)下，取0.10 mL涂布于YEPD平板上，30℃靜置培養(yǎng)，直至有菌落生成。

誘變菌株的篩選：采用平板菌落計(jì)數(shù)方法計(jì)算菌落數(shù)，進(jìn)而計(jì)算得出菌株的致死率，考察菌株致死率與DES濃度的關(guān)系。致死率計(jì)算公式如下：

待菌落長出后，從菌株致死率在80%～90%的平板上挑取生長快、菌落大的單菌落點(diǎn)接于YEPD平板上，并編號。將這些菌株接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵4～6 h，測定突變菌株胞內(nèi)RNA的含量，篩選出RNA含量較高的突變菌株，并對其生產(chǎn)性能進(jìn)行測定。

1.3.2 最優(yōu)突變株糖蜜培養(yǎng)基中發(fā)酵性能的測定

種子液的制備：利用接種環(huán)從斜面上挑取一環(huán)菌泥接種于裝有YEPD培養(yǎng)基的試管中，于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

擴(kuò)大培養(yǎng)：按2%（V/V）的接種量接種于含有250 mL優(yōu)化前糖蜜培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。

發(fā)酵性能的測定：每隔1 h取一次樣，測定樣品的生物量及胞內(nèi)RNA含量，考察最優(yōu)突變株在糖蜜培養(yǎng)基中的發(fā)酵性能。

1.3.3 單因素優(yōu)化糖蜜培養(yǎng)基

采用單因素輪換法，以最優(yōu)突變菌株為試驗(yàn)菌株，對糖蜜培養(yǎng)基成分酵母浸粉含量（0、1%、2%、3%、4%、5%）、磷酸二氫鉀含量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、硫酸亞鐵含量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、硫酸鋅含量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）進(jìn)行優(yōu)化，測定發(fā)酵12 h時(shí)菌體胞內(nèi)RNA的含量，確定培養(yǎng)基中各個成分的最佳濃度。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化糖蜜培養(yǎng)基

表1 糖蜜培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of molasses medium components

根據(jù)單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，以胞內(nèi)RNA含量（Y）為評價(jià)指標(biāo)，選取酵母浸粉含量（A）、磷酸二氫鉀含量（B）、硫酸亞鐵含量（C）、硫酸鋅含量（D）4個因素，進(jìn)行4因素3水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定糖蜜培養(yǎng)基的最優(yōu)配方。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.3.5 RNA含量的測定[19]

菌株的培養(yǎng)：菌種過夜活化，以2%的接種量接至裝有100mLYEPD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30℃、180r/min的條件下培養(yǎng)。

干質(zhì)量的測定：培養(yǎng)2h后，每隔2h取一次樣，以稀釋同樣倍數(shù)的新鮮培養(yǎng)基作空白對照，測定OD600nm值。另取3份20 mL菌液離心去上清，在7 000 r/min條件下離心收集菌體，經(jīng)無菌去離子水重新懸浮，洗滌2次后，于70℃條件下恒溫干燥至恒質(zhì)量，測定細(xì)胞干質(zhì)量。得到對數(shù)期樣品的干質(zhì)量（y）與對應(yīng)OD600nm值（x）的回歸方程：

y=0.382x+0.832，R2=0.9937。

RNA含量的測定：移取在30℃、180r/min的條件下發(fā)酵4 h的發(fā)酵液10 mL，在波長600 nm處測定吸光度值。10 mL發(fā)酵液以5 000 r/min離心10 min，無菌水洗滌兩次，并收集菌體。菌體以5 mL 0.5 mol/L高氯酸溶液重懸，70℃水浴20 min，離心，收集上清液。吸取1 mL上清液定容至50 mL，測量上清液在波長260 nm處的吸光度值，計(jì)算胞內(nèi)總RNA含量（%），計(jì)算公式如下：

式中：A1為A260nm吸光度值；y為酵母干質(zhì)量；32為單位光吸收值；50為稀釋倍數(shù)；5為高氯酸體積，mL；10為發(fā)酵液體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES化學(xué)誘變及高產(chǎn)核酸釀酒酵母的篩選

菌落培養(yǎng)3d后，菌體致死率與DES添加量關(guān)系見圖1A。由圖1A可知，5%（V/V）DES添加量為7.5%，處理30 min時(shí)，致死率接近100%。首先，從致死率在80%～90%范圍的平板上（DES添加量為5%）挑取生長性能良好的菌株9株，編號分別為：BY23-16、BY23-190、BY23-191、BY23-193、BY23-195、BY23-198、BY23-199、BY23-200、BY23-201，然后測定突變菌株胞內(nèi)RNA的含量，測定結(jié)果見圖1B。由圖1B可知，在所挑取的9株突變菌株中，突變株BY23-195的RNA含量最高，為19.56%（P＜0.01），與出發(fā)菌株BY23的核酸含量（16.46%）相比，提高了18.85%。最后，對出發(fā)菌株BY-23以及突變株BY23-195的生長性能進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1C。由圖1C可知，突變株BY23-195的生長性能并未受到影響，且生物量大于出發(fā)菌株BY23，所以選取突變株BY23-195為高產(chǎn)RNA的菌株。

圖1 出發(fā)菌株BY23的致死曲線（A）、突變株的RNA含量（B）及出發(fā)菌株BY23與突變株BY23-195的生長性能比較（C）Fig.1 Results of the lethal curve of original strain BY23(A),RNA contents of mutant strain(B)and comparison of growth performance between mutant strain BY23-195 and original strain BY23(C)

2.2 糖蜜培養(yǎng)基中突變株BY23-195發(fā)酵性能的測定

突變株BY23-195在糖蜜培養(yǎng)基中的發(fā)酵性能的測定結(jié)果見圖2。

由圖2可知，突變株BY23-195在延滯期（0～4 h），菌體生物量變化不大，其OD600nm值從0.18到0.60，RNA含量從1.38%增加至2.62%，說明這段時(shí)間細(xì)胞生長緩慢。在對數(shù)期（5～11 h），菌體生物量直線上升，其OD600nm值從1.09到13.48，RNA含量從7.31%增加至9.84%，說明菌株在對數(shù)期生長迅速，并且大量合成RNA。其次，在發(fā)酵8 h時(shí)，菌株RNA含量達(dá)到最大，為12.68%。在穩(wěn)定期（12h之后），菌株生物量達(dá)到最大，其OD600nm值達(dá)到了14.00，且基本保持不變，其RNA含量也趨于平穩(wěn)，基本保持在9.00%～10.00%。

圖2 突變株BY23-195在糖蜜培養(yǎng)基中發(fā)酵過程中的生長曲線（A）及RNA的含量（B）Fig.2 Growth curve(A)and RNA contents(B)of mutant strain BY23-195 in the molasses medium during fermentation process

2.3 糖蜜培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 酵母浸粉含量的優(yōu)化

圖3 不同酵母浸粉含量對突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量的影響Fig.3 Effects of different yeast extract concentration on intracellular RNA contents of mutant strain BY23-195

由圖3可知，酵母浸粉含量在0～4%時(shí)，酵母胞內(nèi)RNA含量隨酵母浸粉含量的增加而提高，由6.33%提高至13.18%；當(dāng)酵母浸粉含量為4%時(shí)，RNA含量達(dá)到最大，為13.28%，所以酵母浸粉在本試驗(yàn)中的最佳含量為4%。

2.3.2 磷酸二氫鉀含量的優(yōu)化

由圖4可知，磷酸二氫鉀含量在0～0.10%時(shí)，突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量隨磷酸二氫鉀含量的增加而提高，從13.28%提高至14.13%；當(dāng)磷酸二氫鉀含量為0.10%時(shí)，RNA含量達(dá)到最大，達(dá)到了14.13%；當(dāng)磷酸二氫鉀含量＞0.10%之后，RNA含量開始下降，所以磷酸二氫鉀在本試驗(yàn)中的最佳含量為0.10%。

圖4 不同磷酸二氫鉀含量對突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量的影響Fig.4 Effects of different KH2PO4concentration on intracellular RNA contents of mutant strain BY23-195

2.3.3 硫酸亞鐵含量優(yōu)化

圖5 不同硫酸亞鐵含量對突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量的影響Fig.5 Effects of different FeSO4concentration on intracellular RNA contents of mutant strain BY23-195

由圖5可知，硫酸亞鐵含量在0～0.10%時(shí)，突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量隨硫酸亞鐵含量的增加而提高，從11.30%提高至12.31%；當(dāng)硫酸亞鐵含量為0.10%時(shí)，RNA含量達(dá)到最大，為12.31%；在硫酸亞鐵含量＞0.10%之后，RNA含量開始下降，由12.31%下降為10.69%，所以硫酸亞鐵在本試驗(yàn)中的最佳含量為0.10%。

2.3.4 硫酸鋅含量優(yōu)化

圖6 不同硫酸鋅含量對突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量的影響Fig.6 Effects of different ZnSO4concentration on intracellular RNA contents of mutant strain BY23-195

由圖6可知，硫酸鋅含量在0～0.15%時(shí)，突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量隨硫酸鋅含量的增加而提高，從11.06%提高至12.07%；當(dāng)硫酸鋅含量為0.10%時(shí)，RNA含量達(dá)到最大，為12.07%；當(dāng)硫酸鋅含量＞0.15%之后，RNA含量開始下降，由12.07%下降為11.47%，所以硫酸鋅在本試驗(yàn)中的最佳含量為0.15%。

2.4 糖蜜培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，以突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量（Y）為評價(jià)指標(biāo)，選取酵母浸粉含量（Y）、磷酸二氫鉀含量（B）、硫酸亞鐵含量（C）、硫酸鋅含量（D）為評價(jià)因素，進(jìn)行4因素3水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

表2 糖蜜培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of molasses medium components

由表2的極差分析可知，影響突變株BY23-195胞內(nèi)RNA含量的4個因素的主次順序?yàn)镃＞A＞D＞B，即硫酸亞鐵含量＞酵母浸粉含量＞硫酸鋅含量＞磷酸二氫鉀含量。最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A3B1C1D1，即酵母浸粉含量5%、磷酸二氫鉀含量0.05%、硫酸亞鐵含量0.05%、硫酸鋅含量0.10%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證最適發(fā)酵培養(yǎng)基，分別對優(yōu)化前培養(yǎng)基和A3B1C1D1進(jìn)行復(fù)測，優(yōu)化后突變株BY23-195胞內(nèi)RNA的含量為16.01%，與未優(yōu)化之前的13.66%相比，RNA含量提高了17.20%。因此，最優(yōu)培養(yǎng)基為糖蜜（糖度調(diào)至12°Bx），酵母浸粉5%，硫酸銨0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸亞鐵0.05%，硫酸鋅0.10%。

3 結(jié)論

本研究以一株S.cerevisiaeBY23為出發(fā)菌株，通過DES化學(xué)誘變篩選得到了一株胞內(nèi)RNA含量較高的突變株BY23-195，其在YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，胞內(nèi)RNA含量為19.56%，與出發(fā)菌株相比提高了18.85%。其次，通過單因素以及正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最優(yōu)糖蜜培養(yǎng)基配方為糖蜜（糖度調(diào)至12°Bx），酵母浸粉5%，硫酸銨0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸亞鐵0.05%，硫酸鋅0.10%。在此優(yōu)化條件下，突變株S.cerevisiaeBY23-195胞內(nèi)的RNA含量為16.01%，較優(yōu)化前提高了17.20%。