醋酸菌對C57BL/6J小鼠的酒精性肝損傷的影響研究

清野慧至，栗原仁，松岡亮輔，奧山洋平，久能昌朗*，伊豆英惠，程永強，高彥祥，韓北忠

（1.丘比株式會社 研究開發本部，東京 調布 182-0002；2.獨立行政法人酒類綜合研究所 品質與評價研究部門，廣島 東廣島 739-0046；3.中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083）

酒作為社會交流溝通的一種工具，在全球范圍內發揮著作用并被廣為飲用。少量飲酒可降低總死亡風險，但是過度飲酒則會損害身心健康[1]，尤其會增加負責乙醇代謝的主要臟器——肝臟的負擔，因此長期大量飲酒會誘發肝臟疾病。關于其病癥，在初期可見因脂肪蓄積[2]在肝臟或肝細胞損傷而導致谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GTP）流出至血液中[3]。癥狀進一步惡化則會發展成肝炎、肝硬化、肝癌[4]，癥狀越嚴重治療越困難，因此早期的應對措施尤為重要。

肝臟具有多種乙醇代謝途徑，其主要途徑為介導于乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的途徑[5]。當攝取了超過體內ADH及ALDH活性容許量的乙醇時，乙醇和乙醛就會滯留在體內，從而對機體產生各種影響[6]。其中乙醛的毒性較強，會通過氧化應激或形成脂質、蛋白質加合物對肝臟細胞造成傷害[7]。

醋酸菌是一種在食醋釀造過程中使用的革蘭氏陰性需氧菌。醋酸菌產生醋酸是以乙醇為原料，通過酶的作用將其依次氧化為乙醛、醋酸的過程[8]。第一階段的氧化反應在ADH的作用下發生，第二階段的氧化反應在ALDH的作用下發生。

因此提出了同時攝取乙醇與醋酸菌可以減輕乙醇及乙醛毒性的假說。目前為止，已確認通過工業性的大量精制從醋酸菌中提取的具有ADH、ALDH活性的并與乙醇一同攝取，可降低呼氣及血液中乙醇的濃度[9]。由此，有望通過同時攝取醋酸菌來減輕攝取乙醇對肝臟造成的損傷。在本研究中，對同時攝取乙醇和醋酸菌的小鼠的肝功能指標及肝臟脂質蓄積進行了評價，針對醋酸菌對于肝損傷的減輕作用進行了研究探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

醋酸菌[10]：對葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacterhansenii）的培養液進行離心，收集醋酸菌，使用干燥后的非活菌，其ADH及ALDH活性分別為0.56 U/mg、1.38 U/mg。

乙醇、福爾馬林：購自日本和光純藥工業株式會社。酪蛋白、β-玉米淀粉、纖維素、混合礦物質、混合維生素：日本Oriental酵母工業株式會社；蔗糖：日本和田制糖株式會社；玉米油：日本J-OIL MILLS株式會社。

1.1.2 實驗動物與飼料

25只C57/BL6J小鼠（8周齡、雄性、22～27 g、SPF）：購自日本SLC株式會社。將小鼠分別單獨飼養于塑料籠具中，飼養環境為溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%、明暗周期12 h（明期為8AM-8PM）、SPF。飼料及水均為自由攝取。所有的動物實驗均遵照日本國動物保護及管理相關法律（1973年法律第105號）及實驗動物的飼養及保管和減輕痛苦的相關準則（2013年環境省告示第84號），經Kewpie株式會社研究開發本部動物實驗委員會的審查及批準后實施（批準編號：17-03）。

根據AIN-76組成[11]，按照酪蛋白20%、β-玉米淀粉15%、纖維素5%、混合礦物質3.5%、混合維生素1%、蔗糖45.5%、玉米油10%的比例調配試驗飼料。

1.2 儀器與設備

轉氨酶C-Ⅱ測定儀（431-30901）、甘油三酯E-測定儀（432-40201）、磷脂-C測定儀（433-36201）、膽固醇E-測定儀（439-17501）：和光純藥工業株式會社。

1.3 方法

1.3.1 實驗組設置

根據現有報道[12]變更了乙醇的給予。讓小鼠自由攝食試驗飼料7 d，實施預飼養后將其分為對照組、乙醇組、乙醇+醋酸菌組3組。

對照組：為了使對照組小鼠攝入的乙醇和卡路里與其他組小鼠相同，給予了每只小鼠0.25mL的44mg/100mL蔗糖[13]。

乙醇組：用灌胃針及1 mL注射器經口給予小鼠25 mg/100 mL的乙醇，按照0.25 mL（以乙醇量計2.5 g/kg）每天給予3次（9 AM、12 PM、3 PM）。

（乙醇+醋酸菌）組：將醋酸菌10mg混懸于25mg/100mL的乙醇0.25 mL中，給予乙醇+醋酸菌組，同樣每天給予3次（9 AM、12 PM、3 PM）。

在經口給予開始前1h至經口給予結束期間（8AM-3PM）沒有喂食飼料。經口給予開始14 d后，在最后經口給予3 h后，在異氟烷麻醉下進行了腹部后大靜脈采血采樣。

1.3.2 生化學分析

由采集到的血液分離得到血清，供進行各種指標的測定。

AST、ALT通過轉氨酶C-Ⅱ測定儀進行了測定。甘油三酯（triglyceride，TG）、磷脂（phospholipid，PL）、總膽固醇（total cholesterol，T-chol）分別采用甘油三酯E-測定儀、磷脂-C測定儀、膽固醇E-測定儀進行了測定。肝臟的脂質分析采用Folch法提取脂質后再以化學法[14]進行了測定。

1.3.3 組織學分析

將小鼠肝臟以10%福爾馬林進行固定后，制作了冷凍組織塊。切片的制作委托給日本Techno-Science株式會社。制作成6μm厚度的冷凍切片，進行蘇木精-伊紅染色及油紅O染色以供進行組織學分析[13]。

1.3.4 統計學分析

使用IBM SPSS Statistics 20統計分析軟件進行統計學分析。由于對照組出現了2.44 g/100 g體質量的低于單位體質量肝臟質量平均值（3.50 g/100 g）體質量30%以上的個體，所以將該動物個體從統計分析的對象中排除。此外，在乙醇組和乙醇+醋酸菌組，相對于其各組體質量變化率的平均值-6.05%、-6.90%，乙醇組出現了體質量變化率-10.9%，乙醇+醋酸菌組出現了體質量變化率-10.7%和-12.4%的個體，因此也將其從統計分析的對象中排除。最終進行了統計分析的個體數為對照組：n=8、乙醇組：n=7，乙醇+醋酸菌組：n=6。通過Tukey檢驗對其顯著性差異進行比較，（P＜0.05）表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 對小鼠生長發育參數及肝臟質量的影響

小鼠生長發育參數及肝臟質量的測定結果如表1所示。

表1 小鼠生長發育參數及肝臟質量Table 1 Growth parameters and liver mass of mices

由表1可知，乙醇組與（乙醇+醋酸菌）組的最終體質量、體質量增加量、攝食量均顯著低于對照組的數值（P＜0.05），但是乙醇組與（乙醇+醋酸菌）組之間并未見顯著性差異（P＞0.05）。乙醇組的肝臟質量顯著高于對照組和（乙醇+醋酸菌）組（P＜0.05）。

2.2 對小鼠血液生化學指標的影響

小鼠血清的生化學檢查結果如表2所示。

組別 對照組 乙醇組 （乙醇+醋酸菌）組AST/（IU·L-1）ALT/（IU·L-1）TG/（mg·100 mL-1）PL/（mg·100 mL-1）T-chol/（mg·100 mL-1）15.5±0.5c 4.0±0.2b 46.7±5.8 192.4±7.6 89.5±4.5 48.0±4.9a 15.8±2.6a 72.9±13.6 192.8±8.7 88.0±4.7 28.8±2.6b 8.1±0.8b 57.9±4.8 183.5±6.6 81.1±2.9

由表2可知，乙醇組的肝功能指標AST及ALT顯著高于對照組（P＜0.05）。此外，（乙醇+醋酸菌）組的AST、ALT則顯著低于乙醇組（P＜0.05）。而甘油三酯、磷脂、總膽固醇這三組間未見顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 對小鼠肝臟脂質蓄積的影響

小鼠肝臟的脂質影響分析結果如圖1所示，小鼠肝臟組織學分析結果如圖2所示。

由圖1可知，對照組的甘油三酯量和膽固醇量分別為（12.6±1.0）mg/g、（4.82±0.10）mg/g肝臟，與之相比，乙醇組分別為（77.3±11.0）mg/g、（6.30±0.20）mg/g肝臟，顯著高于對照組（P＜0.05）。乙醇+醋酸菌組的甘油三酯量和膽固醇量分別為（38.6±5.9）mg/g、（5.26±0.24）mg/g肝臟，顯著低于乙醇組（P＜0.05）。關于磷脂量，3組間未見顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 乙醇和醋酸菌對于脂質在小鼠肝臟中蓄積的影響Fig.1 Effect of acetic acid bacteria extract and ethanol on lipid accumulation in liver of mices

圖2 小鼠肝臟脂質積累的組織學分析Fig.2 Histological analysis of lipid accumulation in liver of mices

由圖2可知，通過組織學分析，可見乙醇組的肝臟中存在中性脂質的蓄積。（乙醇+醋酸菌）組與乙醇組相比較，中性脂質的蓄積較輕微。

3 討論

攝入乙醇導致肝損傷的癥狀，因攝入的乙醇量及時間不同而有所不同。酒精性肝損傷模型關于乙醇的使用量、時間長短、方法，有各種各樣的報道。急性模型中會一次性給予較大量的乙醇（約5 g/kg）[15]。慢性模型中會在持續較長的一段時間（4～6周）給予較少量含有乙醇（1%vol～5%vol）的飼料[16]。在本研究中，連續14d，每天3次，間隔3 h經口給予乙醇2.5 g/kg。這樣的給予安排可以認為是介于上述急性模型和慢性模型中間的位置。

據報道，過量攝入乙醇會誘導肝功能指標AST、ALT的升高以及甘油三酯和膽固醇在肝臟中的蓄積[2-3]。在此次的試驗中，通過在給予乙醇的同時給予醋酸菌，抑制了乙醇導致的AST、ALT的升高和甘油三酯、膽固醇在肝臟中的蓄積。在現有報道中，人在攝入乙醇時，同時攝入醋酸菌與不攝入醋酸菌相比較，發現呼氣及血液中的乙醇濃度有所降低[9]。關于醋酸菌的作用機制，推測可能是由于醋酸菌中所含的ADH和ALDH使乙醇分解。但本試驗的結果表明，通過醋酸菌的服用酒精性肝損傷的改善程度為AST減少40%、ALT減少49%、TG減少50%。比過去試驗中顯示的抑制血液中的乙醇濃度的上升作用更高（24%）。研究表明醋酸菌可以防止發酵食品kombucha tea的氧化，對肝功能有保護作用[17]。本試驗中使用的醋酸菌也可能對肝臟具有保護作用。本研究尚未明確對肝臟的影響，為今后的研究課題。

此次試驗中，無論乙醇與醋酸菌灌胃與否，血清的脂質參數（甘油三酯、磷脂、總膽固醇）沒有顯著差異（P＞0.05）。過去的報告中，灌胃乙醇會導致血清的甘油三酯，總膽固醇濃度的上升[11，17]。認為此差異是一次灌胃的乙醇量不同造成的。本試驗中灌胃2.5 g/kg的乙醇。而前述的報告灌胃了5g/kg的乙醇。

乙醇組和（乙醇+醋酸菌）組小鼠的攝食量和體質量增加量，與不給予乙醇的對照組相比較，呈現顯著低值。在過去的研究文獻中，有報道稱攝入乙醇會減少食物攝入量和降低了體質量增加[17]。然而，由于本次試驗中乙醇組和（乙醇+醋酸菌）組之間沒有顯著差異，認為在此次試驗系統中適宜地評價了乙酸菌對乙醇給藥的影響。

在過去的研究中，報道了幾種減輕酒精性肝損傷的天然成分。如類黃酮的一種木犀草素，可以減少由于攝入乙醇造成的肝臟中脂肪的蓄積[17]。此外，S-腺苷甲硫氨酸表現出對攝入乙醇時產生的活性氧的抗氧化作用[19]。所有這些均是直接影響肝臟從而抑制肝損傷的。此外，醋酸菌具有減低呼吸以及血液中的乙醇濃度的作用[9]與其他素材相比具有特殊性。通過醋酸菌與直接影響肝臟的天然成分配合使用，有望能夠得到疊加或協同效果。

4 結論

本研究的結果表明，與對照組相比較，乙醇組小鼠的AST與ALT濃度，肝臟甘油三酯與膽固醇濃度顯著增高（P＜0.05）；（乙醇+醋酸菌）組的數值則顯著低于乙醇組（P＜0.05）。攝入醋酸菌可減輕因使用乙醇誘發的AST、ALT升高和脂肪在小鼠肝臟中的蓄積。