中華稻蝗血細(xì)胞分裂相的研究方法初探

王耀，張小民

（1.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600；2.山西大學(xué)，山西太原 030006）

1 研究概況

1.1 對中華稻蝗的研究現(xiàn)狀

中華稻蝗[Oxya chinensis(Thunb.)]是直翅目斑腿蝗科的一種非遷飛性昆蟲，同一科內(nèi)有約9000種，我國有記載的有300余種，科內(nèi)共有稻蝗屬約20種，我國約有10種，分布以中華稻蝗最廣。中華稻蝗在我國華東、華中、華南、華北及東北等地均有分布，多棲憩在禾本科植物的莖葉上，并以此為食，例如水稻、高粱、玉米等作物多受其害。在山西省，中華稻蝗主要分布于晉北、晉中和晉南的低洼、潮濕地帶，該區(qū)是全省水稻的主要種植區(qū)。這一生態(tài)系統(tǒng)中，中華稻蝗是山西省水稻的主要害蟲，占了蝗蟲總量的90%。

1.2 蝗蟲血細(xì)胞研究概況

對于蝗蟲血細(xì)胞的研究雖然開始較早，但大部分是注重形態(tài)研究與分類學(xué)的研究。對于蝗蟲血細(xì)胞功能、特性的研究較少，但近年來也逐漸為人所關(guān)注。比如，（1）昆蟲造血器官和造血干細(xì)胞的研究，昆蟲的造血器官是指產(chǎn)生血細(xì)胞的囊狀結(jié)構(gòu)，一些干細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞聚集而成，網(wǎng)狀細(xì)胞包圍在造血干細(xì)胞周圍，并保護(hù)干細(xì)胞誘導(dǎo)其分化。（2）昆蟲血細(xì)胞功能的研究，蝗蟲血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和分類的研究長期混亂，嚴(yán)重影響了其他方面工作的深入，對血細(xì)胞功能方面的研究至今處于初級階段，多屬于推論，有些由于實驗證據(jù)不足或?qū)嶒炇侄侮惻f而未被進(jìn)一步證實。另外，由于昆蟲血細(xì)胞形態(tài)多樣和中間類型的存在，即使是同一種昆蟲，在不同蟲態(tài)、不同蟲齡及不同生態(tài)、生理時都會發(fā)生變異。近年來，發(fā)現(xiàn)蝗蟲體液中有許多死亡或凋亡的細(xì)胞，以及器官或組織中脫落的非細(xì)胞物質(zhì)，同時又沒有使用相同的染色方法，因此對每種血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征沒有嚴(yán)格統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。用于命名每種細(xì)胞類型的術(shù)語對于一種或另一種昆蟲來說是經(jīng)常有所不同，比如漿血胞的細(xì)胞質(zhì)中有沒有顆粒目前說法不一，在大多數(shù)鱗翅目種類中，漿血胞缺乏顆粒[1]，但在蠟蛾中包含顆粒[2]；又如漿血胞的吞噬作用是有爭議的，有一些學(xué)者認(rèn)為它們是吞噬細(xì)胞[3]，而另一些學(xué)者認(rèn)為它們明顯不是吞噬細(xì)胞[4]，故其形態(tài)也是有爭議的，如有沒有偽足等結(jié)構(gòu)；又如在果蠅中被稱為漿血胞的血細(xì)胞，與鱗翅目中的漿血胞不同，它們有不同的組織和細(xì)胞學(xué)特征，在單層血涂片中有不同的行為和不同的功能[5]；又如粒細(xì)胞的主要功能之一是吞噬，這已被許多的學(xué)者在昆蟲體內(nèi)和體外觀察到，果蠅沒有真正的血細(xì)胞，但是果蠅中的漿血胞比鱗翅類昆蟲的漿血胞更像粒細(xì)胞[5]，鱗翅類的粒細(xì)胞和果蠅的漿血胞也被Nardi[6]和Ling[7]所強(qiáng)調(diào)；又如象鱗翅類的類絳色血細(xì)胞一樣，在果蠅晶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的包涵體是沒有膜包被的[8]。晶細(xì)胞中別的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器，有與鱗翅類絳色血細(xì)胞相同的特征。此外，由于他們的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征，它們在體外的行為和多酚氧化酶等，不同的學(xué)者已經(jīng)將黑腹果蠅的晶細(xì)胞闡述為類絳色血細(xì)胞[9]，他們還建議用類絳色血細(xì)胞替代晶細(xì)胞。此外，鱗翅類[10]和果蠅[11]的類絳色血細(xì)胞似乎來源于造血器官。到目前為止，珠血細(xì)胞存在于所有研究的鱗翅類昆蟲中，這些細(xì)胞也在果蠅幼蟲的最后階段觀察到，但絕不能與真正的珠血細(xì)胞相混。

對于昆蟲血細(xì)胞的形態(tài)和分類學(xué)術(shù)界分歧和困惑很多，這不僅帶來了血細(xì)胞的分類困難，而且還嚴(yán)重影響了對其生理功能、生化等方面的研究。

2 研究方法

2.1 對PHA（植物血凝素）的研究

PHA是利用超低溫冷凍技術(shù)從紅蕓豆中提取的一種物質(zhì)，它作為一種有絲分裂原，可以激活免疫細(xì)胞——淋巴細(xì)胞、刺激細(xì)胞增殖，雖較難提純且成本極高，但作為藥劑，PHA已直接用于動物及人體，如林義浩[12]以體內(nèi)注射PHA制備魚類腎細(xì)胞染色體，其發(fā)現(xiàn)在近30種魚類注射PHA均具有刺激腎細(xì)胞有絲分裂的作用，而且分裂指數(shù)都很高。

2.2 對秋水仙素的研究

秋水仙素可以抑制有絲分裂，破壞紡錘體，并將染色體停滯在分裂的中期，它是多倍體誘變的最佳試劑。自美國學(xué)者A.F.Blakeslee與其團(tuán)隊于1937年成功使用秋水仙素處理曼陀羅等植物，使其染色體成功加倍以來，秋水仙素就被廣泛地應(yīng)用于多種科研工作中，如遺傳學(xué)研究、細(xì)胞學(xué)研究、植物育種等。除此之外，秋水仙素還作為臨床藥物作用于動物體和人體，有抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞等多方面藥理作用。如秋水仙堿通過干擾溶酶體脫顆粒降低中性粒細(xì)胞的活性、黏附性及趨化性，并可抑制粒細(xì)胞向炎癥區(qū)域遷移，以此發(fā)揮其抗炎作用。此外，秋水仙素可以干擾細(xì)胞間黏附分子及選擇蛋白的表達(dá)，繼而阻礙T淋巴細(xì)胞活化和對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而抑制炎癥反應(yīng)。譚秀華[13]等在2007年研究了秋水仙堿對小鼠骨髓細(xì)胞有絲分裂的影響，近期的研究還發(fā)現(xiàn)秋水仙堿能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體外的生長，還有誘導(dǎo)凋亡作用，但體內(nèi)的效果尚待臨床研究。

2.3 研究所用染色方法

目前，對昆蟲血細(xì)胞形態(tài)及分類的研究較為廣泛，但仍沒有一個統(tǒng)一的染色方法，雖然Jone在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了歸類，但也是基于Giemsa和Wright兩種染色方法。到目前為止對昆蟲血細(xì)胞研究仍然在使用的方法有吉姆薩、賴特、中性紅、蘇木精、甲苯胺藍(lán)等，最廣泛使用的昆蟲血細(xì)胞形態(tài)分類是吉姆薩染色和賴特染色。本文采用賴特-吉姆薩混合染色法對中華稻蝗血細(xì)胞進(jìn)行染色。

2.4 研究樣品處理方法

本次研究用蝗蟲血細(xì)胞為材料來研究蝗蟲的細(xì)胞分裂相，取中華稻蝗雌性、雄性各20只，在其腹節(jié)注入1%的PHA 15μL，12小時后加入0.2%秋水仙素2μL，再12小時后制作血液涂片，用賴特-吉姆薩混合染色15分鐘，沖洗后觀察。另取中華稻蝗雌性、雄性各20只，同法將PHA注入蝗蟲體內(nèi)，36小時后以秋水仙素處理，再12小時后制作血液涂片，用賴特-吉姆薩混合染色后觀察。

以此類推分別于1天、2天、3天、4天后觀察染色處理過的中華稻蝗血細(xì)胞涂片，從而得出中華稻蝗細(xì)胞分裂相照片。

對照組取同數(shù)量蟲體，注射等量無菌水代替PHA，其余操作一致。

使用PHA的效價為10 μg/mL，秋水仙素純度為95%。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

不同分裂時期中華稻蝗細(xì)胞分裂相照片如圖1、圖2、圖3所示。通過對血涂片的觀察，發(fā)現(xiàn)加入PHA以后，可刺激蝗蟲血細(xì)胞分裂，血量明顯增加，在加入PHA 1天后就有5%的血細(xì)胞開始分裂，許多血細(xì)胞的染色體開始凝集；而在加入PHA 2天后仍有5%的分裂細(xì)胞；3天以后明顯減少。PHA處理可得到全部的細(xì)胞分裂各期的分裂相，且所得結(jié)果清晰、容易分辨。

圖1 分裂前期

圖2 分裂中期

圖3 分裂末期

3.2 討論

本研究用蝗蟲血細(xì)胞為材料來研究蝗蟲的細(xì)胞分裂相，蝗蟲的血細(xì)胞雖然不是周期細(xì)胞，但可以通過PHA刺激血細(xì)胞分裂從而得到周期細(xì)胞，進(jìn)而可以觀察到蝗蟲血細(xì)胞的分裂過程。本實驗用PHA處理蝗蟲細(xì)胞尚屬首次，此法擺脫了采集被試材料性別、部位的限制，比前人所用方法簡單實用、結(jié)果穩(wěn)定性佳。從觀察結(jié)果來看，蝗蟲注入PHA在4天后只有1%的分裂細(xì)胞，說明在處理之后的一段時間細(xì)胞分裂已基本恢復(fù)，因此在實驗時不需要殺死蝗蟲，可以達(dá)到反復(fù)使用、可持續(xù)發(fā)展。