楊浩宇

（長安大學材料學院高分子材料與工程系，陜西西安 710021）

皮膚是人體最大的器官，在抵御病原微生物入侵、維持內環境穩態方面具有重要的作用。當皮膚損傷時，傷口敷料能夠起到維持創面濕潤環境、預防感染和防止二次傷害等作用[1]，進而加快皮膚愈合，改善愈合質量。當傷口較大，甚至損傷大血管時，患者出血量較大，嚴重時會導致患者死亡。在此背景下，開發具備止血促凝功能的新型傷口敷料具有顯著的醫療和經濟價值。

大豆分離蛋白是一種從天然大豆中提取出的球型蛋白質，具有儲量豐富、價格低廉、對環境無污染等優勢，近年來在人造塑料、藥物載體、包裝材料等領域得到了較為廣泛的應用[2]。與此同時，大豆分離蛋白還具有良好的細胞相容性、血液相容性和低免疫原性，在組織工程方面具有一定的應用潛力[3]。陳云等制備了一種戊二醛交聯的羥乙基纖維素/大豆分離蛋白復合膜，并在促進傷口愈合方面取得了一定的效果[4]。

γ-聚谷氨酸是經由芽孢桿菌發酵制備的一種高分子聚合物，具有極佳的親水保濕性能，并且可在生物體內溶菌酶的作用下降解[5]。γ-聚谷氨酸具有一定的生物活性，其降解產物谷氨酸可被細胞膜表面谷氨酸受體識別。此外，γ-聚谷氨酸還具有良好的止血促凝的效果[6]。將γ-聚谷氨酸混入大豆分離蛋白中，可能賦予大豆分離蛋白膜新的特性。

在前期的工作中，筆者制備了大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸物理共混膜。該物理共混膜遇水極易溶解。為了進一步增強復合膜的耐水性能，采用乙二醇二縮水甘油醚對兩種組分進行了交聯，所獲得的大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸的耐水性和力學強度可以得到顯著的提升[7]。

在本次研究中，以大豆分離蛋白和γ-聚谷氨酸為主要原料，乙二醇二縮水甘油醚為交聯劑，通過溶液干燥法制備了大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜。通過掃描電子顯微鏡對復合止血膜的微觀結構進行了觀察，采用MTT實驗和血漿抗凝實驗對復合止血膜的細胞相容性和促凝血作用進行了評價。希望該大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜具有良好的細胞相容性和止血促凝效果，并能作為新型傷口敷料應用于皮膚組織工程領域。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

大豆分離蛋白：蛋白干基＞90%（億鑫生物科技有限公司）；γ-聚谷氨酸：含量＞99%（福瑞達生物科技有限公司）；乙二醇二縮水甘油醚：AR（常州市潤翔化工有限公司）；乙醇：AR（江西同盟試劑化工廠）；氫氧化鈉：GR（天津科密歐化學試劑有限公司）；冰醋酸：AR（天津科密歐化學試劑有限公司）；85-2型機械攪拌機：金壇市新航儀器廠；LGJ-18型大容量冷凍離心機：北京華瑞科學器材。

1.2 樣品的制備

將10g大豆分離蛋白分散在60g去離子水中，然后加入30g5%氫氧化鈉溶液，充分攪拌得到質量分數為10%大豆分離蛋白溶液。將3gγ-聚谷氨酸溶解在97g去離子水中，達到質量分數為3%的γ-聚谷氨酸溶液。將上述的兩種溶液混合，其中大豆分離蛋白與γ-聚谷氨酸的質量比為2:1。向上述的共混溶液中加入占總溶質干重50%的乙二醇二縮水甘油醚，繼續機械攪拌10min。將溶液轉移到離心管中，3000r/min離心15min脫氣泡，將溶液倒入平皿中，溶液的厚度為5mm。溶液自然晾干后揭膜，浸入5%醋酸溶液中30min中和氫氧化鈉，然后流水沖洗48h，再次晾干得到大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜。

1.3 掃描電子顯微鏡觀察

將復合止血膜材料經過液氮冷凍10 min，低溫淬斷，隨后真空干燥4 h，將樣品的斷面貼于銅臺表面并離子濺射儀噴金鍍膜。在20 kV冷場加速電壓下，觀察復合膜表面和斷面的形態。

1.4 MTT實驗

將膜材料粉碎，高壓滅菌20 min，烘干備用。按照“樣品質量（g）/浸提介質（mL）=0.2 g/mL”的比例，稱取材料樣品1 g，加入5 mL的RPMI1640培養基，置于恒溫培養箱中于37 ℃環境下72h。隨后1000 r/min離心10 min，提取上清液作為浸提液。消化L929細胞，以濃度為1×103cells/mL的細胞懸液接種到96孔培養板中。設置陰性對照組以及空白對照組，然后置于37 ℃，5% CO2下培養箱中孵化24h。隨后棄去原培養液，加入無菌PBS漂洗；加入培養基并在實驗組加入50 μL樣品浸提液，陰性對照組依舊加入等量完全培養基；繼續在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h、48 h、72 h。隨后以20 μL/孔的比例往96孔細胞培養板中加入濃度為5 mg/mL的噻唑藍（MTT）溶液并在37 ℃下繼續培養4 h；然后小心棄去培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩幾分鐘后用酶標儀檢測在495 nm處各孔的吸光光度值（OD）。

1.5 血漿抗凝實驗

收集新鮮兔血，并立即與3.8%檸檬酸三鈉溶液按9∶1的比例混合均勻。將上述的全血于3000r/min離心15min，收集上清得到乏血小板血漿。將復合膜材料剪成1 mm×1mm片狀，烘干備用。活化部分凝血活酶時間試劑盒購于南京建成試劑有限公司，檢測過程參照商業試劑盒說明書進行。

2 結果與討論

2.1 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜的微觀結構

復合止血膜材料的微觀形貌通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察得到。如圖1所示，復合膜材料的表面和斷面均較為光滑，并無微相分離現象發生，提示大豆分離蛋白分子和γ-聚谷氨酸分子之間具有良好的親和性。這種現象可部分歸因于乙二醇二縮水甘油醚的交聯作用。在交聯劑的作用下，組分高分子之間形成了廣泛的化學交聯和氫鍵交聯，有助于提高復合膜的穩定性、耐水性和力學強度。

圖1 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜的表面和斷面結構

2.2 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜的細胞相容性

小鼠成纖維細胞系（L929）可模擬動物皮膚細胞，廣泛用于評價止血材料的細胞相容性。細胞相容性通過MTT實驗評價。如圖2所示，浸提液處理組的相對增殖率與對照組相比在第一天沒有顯著性的差異。在第2天和第3天，浸提液處理組的相對細胞增殖率逐漸降低，說明復合止血膜材料對皮膚細胞生長具有一定的抑制作用。然而，浸提液處理組的相對細胞增殖率始終超過80%，參照細胞毒性分級標準GB/T168886.5-2003，該大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜的細胞毒性達到了生物醫用材料1類標準，滿足傷口敷料細胞毒性的一般要求。

圖2 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜細胞相容性的結果

2.3 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜的促凝血功能

復合止血膜的促凝血功能通過新鮮兔乏血小板血漿測定。如圖3所示，正常對照組的活化部分凝血活酶時間APTT為（28.77±0.66）s，在正常參考范圍之內。復合止血膜處理組的活化部分凝血酶原時間APTT為（24.80±0.86）s，顯著低于正常對照組，其差異均具有統計學意義（P＜0.05）。上述實驗結果表明：大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜能夠激活血漿內源性凝血途徑和共同途徑，具有一定的止血促凝功效，有望應用于傷口止血。

圖3 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜的活化部分凝血活酶時間

3 總結

本研究制備了一種乙二醇二縮水甘油醚交聯的大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜。掃描電子顯微鏡的結果表明該復合止血膜具有均一的表面和斷面結構，組分高分子之間具有良好的親和性。MTT實驗結果表明該復合止血膜具有較好的細胞相容性，符合生物材料1類標準。血漿抗凝實驗結果表明該復合止血膜能夠激活內源性凝血途徑和共同通路途徑，具有一定的止血促凝效果。本研究制備的大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復合止血膜可以作為新型傷口敷料，有望應用于皮膚組織工程領域。