表達綠色熒光蛋白的重組海分枝桿菌的構建

劉梓健，彭寶洲，粟海波

（廣州醫科大學-廣州生物醫藥與健康研究院聯合生命科學學院，廣東廣州 511436）

結核病（tuberculosis，TB）由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起，是所有疾病中最致命的傳染性疾病。據世界衛生組織統計，2017年結核病仍然是全世界最具威脅性的細菌感染病，死亡人數多達170萬人，全球約有1/4的人口有結核分枝桿菌潛伏感染[1-2]。卡介苗（BCG）疫苗作為唯一全球廣泛使用的疫苗，不足以防治Mtb感染。目前，多種新疫苗保護效果不能完全令人滿意。并且隨著越來越多的Mtb菌株對現有抗結核藥物產生抗藥性，防治TB非常嚴峻[3-5]。因此，根據之前的不足，研究結核病發病機制以及尋找新型、高效結核疫苗，防治結核病有著重大的意義。

直接研究Mtb影響了抗結核藥物研發的效率。由于海分枝桿菌（Mycobacterium Marinum，M.Marinum）與MTB的基因相似性高達95%以上，且其生長更快、毒力更小、傳染性更低，研究可在二級生物實驗室內進行，因而M.Marinum是研究Mtb的優良模式病原[6]。

綠色熒光蛋白（Green Fluorescence Protein，GFP）由GFP基因編碼，在近紫外或藍光激發時就能輻射出綠色熒光，因而GFP常常作為分子生物學和細胞生物學中用于示蹤和定量的研究工具[5,7]。

本研究中，將增強型綠色熒光蛋白基因（EGFP）克隆到海分枝桿菌的表達載體pMV261，利用EGFP為示蹤基因標記M.Marinum，有利于后續觀察其基因表達調控，將對研究TB發病機制以及研制新型結核疫苗有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

pMV261質粒；pEGFP-N1細菌；引物P1（5'-GGGGTACCAGCTCAAGCTTCGAATTCTGC-3'）和 P2（5'-CCATCGATACCTCTACAAATGTGGTAT GGCT-3'），下畫線部分分別為kpnⅠ和ClaⅠ酶切位點，由上海生物工程有限公司合成；kanamycin sulfate、限制性內切酶ClaⅠ和kpnⅠ購自上海生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Takara；Hot Start Taq 2× Master Mix購 自 BioLabs；T4DNA連接酶、DH5α感受態細胞、質粒小提試劑盒購自TIANGEN；電擊杯購自BIORAD。

1.2 方法

1.2.1 增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的擴增

質粒pEGFP-N1為模版，P1和P2為引物，PCR反應體系（50 μL）：Taq 2× Master Mix 25 μL，引物P1和P2各1 μL，pEGFP-N1質粒1 μL，超純水22 μL。反應條件如下：95 ℃預變性3 min；再分別95 ℃變性 30 s、56 ℃復性 1 min、68 ℃延伸 1 min，30個循環；最后68 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR產物用DNA純化試劑盒回收和純化，并取適量樣品用1.5%瓊脂糖凝膠進行鑒定。

1.2.2 含有EGFP基因重組表達質粒pMV261-EGFP的構建

將回收純化的PCR產物用kpnⅠ和ClaⅠ雙酶切并用DNA純化試劑盒純化回收。pMV261質粒用kpnⅠ和ClaⅠ雙酶切后，用1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，并且進行膠回收。酶切產物分別回收后，利用T4DNA連接酶于4 ℃連接過夜，產物轉化入E.coli DH5α后，涂布于含0.1% kanamycin sulfate的LB瓊脂平板。37℃培養過夜，挑取抗性菌落，并搖菌擴培。

1.2.3 pMV261-EGFP重組質粒的鑒定

從含有pMV261-EGFP的大腸桿菌中提取質粒。以P1和P2為引物，利用PCR技術擴增重組質粒上的目的基因，再通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。鑒定成功后，通過測序鑒定目的基因序列。

1.2.4 海分枝桿菌的電感受態細胞的制備和電轉化

將海分枝桿菌接種于10 mL 7H9液體培養基中培養3天，離心收集細菌。先后分別用10 mL、2 mL冰冷的10%甘油滅菌水溶液冰浴2 h，離心棄上清。500 μL的10%甘油重懸細胞后，分裝制成多管海分枝桿菌的電感受態細胞，-80 ℃凍存備用。100 μL海分枝桿菌的電感受態細胞中加入5 μL重組質粒pMV261-EGFP，混勻，移入0.2 mm的電擊杯，冰浴放置10 min。利用電擊杯儀進行電轉化。反應條件：電阻1 000 Ω，電壓2.5 kV，電容25 μF，轉化時間17 ms。電轉后立即將細菌轉入10 mL 7H9液體培養基振蕩培養4 h。離心收集菌體，立即涂布于含0.1%kanamycin sulfate的7H10瓊脂平板。37 ℃培養3天。挑取卡那霉素抗性的單菌落，分別接種于5 mL含0.1%kanamycin sulfate的7H9液體培養基，37 ℃培養 3 天[7]。

1.2.5 Western blot檢測重組質粒EGFP蛋白的表達

裂解適量細胞后，上清中取4 μL待測蛋白加入到1 μL 4×上樣緩沖液。95 ℃變性5 min后，先后進行12% SDS-PAGE電泳和電轉膜。用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫搖床封閉2 h。TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。室溫下分別用anti-GFP一抗和anti-Rv21453一抗孵育PVDF膜，4 ℃過夜孵育。孵育后，洗膜3次，每次10 min。再與羊抗小鼠IgG二抗室溫下孵育1 h。洗膜3次，每次10 min。最后化學發光顯色。

1.2.6 海分枝桿菌感染THP-1吞噬細胞模型建立

感染時按細菌∶細胞=10∶1的比例，取適量細菌懸液加入已經貼壁培養的THP-1細胞六孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中孵育1天。制備感染海分枝桿菌的THP-1巨噬細胞標本，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結果分析

2.1 EGFP基因的擴增結果

EGFP純化后，在1.5%的瓊脂糖凝膠下電泳，在約700 bp處可見1條特異DNA條帶，如圖1所示。預期大小約為717 bp，擴增結果與預期相符。

圖1 EGFP基因PCR擴增結果

2.2 pMV261-EGFP重組質粒的鑒定結果

連接產物用引物P1、P2進行PCR擴增。結果與預期的大小相符，在約700 bp處有一條特異DNA條帶（圖2），對陽性克隆重組質粒pMV261-EGFP進行序列測定，目的基因序列與預期的一致，說明重組質粒pMV261-EGFP構建成功。

圖2 重組質粒pMV261-EGFP PCR鑒定結果

2.3 Western blot檢測結果

Western blot結果表明，海分枝桿菌內EGFP蛋白表達，印跡出現位置約為25 kDa處，如圖3所示。

圖3 Western blotting結果

2.4 重組海分枝桿菌的證實

構建海分枝桿菌感染TPH-1巨噬細胞模型，并制備成相應的標本，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見TPH-1巨噬細胞內有釋放綠色熒光的海分枝桿菌（圖4），故海分枝桿菌感染TPH-1巨噬細胞模型構建成功，證實轉化pMV261-EGFP的重組海分枝桿菌構建成功。

圖4 重組結核分枝桿菌的熒光鑒定

3 討論

耐多藥結核病（MDR-TB）的流行以及廣泛耐藥結核病（XDR-TB）的出現，導致多種候選疫苗在抗結核潛伏感染臨床保護效果及運用前景方面尚不能完全令人滿意，這也表明人類結核病正在加入抗生素后時代的細菌性疾病。TB對人類健康的持續造成威脅，對全球結核病疾病控制帶來了巨大挑戰。尋求新型、安全、高效的抗結核藥物是一個重要的研究課題[4-5]。結合之前對防治TB的研究，再次研究結核發病機制以及研制新型疫苗是有必要及可行的。

由于Mtb生長緩慢，而且受到其生物安全性的極大制約，故制約了對細菌致病性研究以及抗結核藥物研發的效率。M.Marinum生長更快、毒力更小、傳染性更低，對實驗環境條件要求較低，便于后續通過構建斑馬魚海分枝桿菌模型進行基礎研究。

增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為報告基因，它具有多方面的優點。（1）它易于構建載體，轉化后細胞也可以繼續傳代。（2）作為熒光標記分子，熒光的產生不需要任何外加底物，酶或其他共反應因子，熒光穩定。因而其表達與激光共聚焦顯微鏡結合，可方便觀察轉染后細胞的增殖和分化等生理功能變化[5,7-10]。

本研究中，構建了重組質粒pMV261-EGFP，并使該重組質粒pMV261-EGFP在M.Marinum中穩定存在并表達，成功獲得可自發釋放熒光的M.Marinum。這將便于后續研究MTB的基因表達調控、結核病發病機制以及研制新型結核疫苗，以期對結核病的早期發現、成功治療和有效的預防有更新發現。