胡俊

（武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北武漢 430023）

1 研究背景

1.1 有效氮、磷、鉀的測定原理

氮、磷、鉀是植物生長發育所必需的元素，也是耗需量最大的三種元素。在土壤中，氮、磷、鉀基本上是以有機化合物的形式存在，不能夠被植物直接利用。在農業生產中，有效氮、磷、鉀的含量是衡量土壤肥力、指導生產的一項重要指標。本試驗用比色法檢測有效氮、磷、鉀的含量，先配制各個元素的標準溶液，繪制標準曲線，再用不同溶液分別浸提土壤樣本中的有效氮、磷、鉀，并比色，最后進行計算分析。

1.2 本試驗的意義

我國是一個農業大國，農業是我國國民經濟的基礎。我國的歷史是建立在農業發展的基礎上的，社會的一切生產發展始于農業，農業發展帶動了輕重工業的發展，以及第三產業的發展。對農業來說，農作物的生長狀況就是重中之重了。作物對氮、磷、鉀的耗需量非常大，而土壤中可供作物快速吸收利用的有效態的氮、磷、鉀卻很少[5]。

目前，對土壤中有效氮、磷、鉀的研究主要集中在某地區不同時間或者同一時間不同地區，有效氮、磷、鉀在土壤中含量的變化，而對快速檢測方法的研究很少。因此，能夠快速準確的檢測土壤中有效氮、磷、鉀的含量，并以此為根據，結合作物所需的有效氮、磷、鉀指導農民進行施肥等作業就很有必要。

2 材料、儀器與試劑

2.1 試驗材料

500g新鮮土壤，取自張公堤附近10～20 cm深處的土壤。

2.2 儀器設備與試劑

2.2.1 設備

恒溫往復式震蕩機、離心機、紫外分光光度計、酸度計和火焰光度計。

2.2.2 試劑

氯化鉀，硝酸鉀，無氨水，氫氧化鈉，碘化鉀，碘化汞，酒石酸鈉，氯化銨，2,4-二硝基酚，0.5 mol/L硫酸溶液，鉬酸銨，5 g/L酒石酸銻鉀溶液，抗壞血酸，5 mg/L磷標準溶液，無磷活性炭，鹽酸。

3 試驗方法

3.1 硝態氮的測定

3.1.1 試劑配制

（1）氯化鉀浸提液。精確稱取74.55 g氯化鉀置于燒杯中，加入約400 mL水溶解。溶解后轉移到1000 mL容量瓶中定容，搖勻，得到1 mol/L氯化鉀溶液。

（2）硝態氮標準儲備液。精確稱取7.2182 g經（110±5）℃烘干2 h的硝酸鉀置于燒杯中，加入約50 mL水溶解。溶解后轉移到1000 mL容量瓶中定容，搖勻，得到1000 mg/L硝態氮標準儲備液，于0～4 ℃冰箱內保存。

（3）硝態氮標準中間液。吸取硝態氮標準儲備液10.0 mL于100 mL容量瓶中定容，搖勻，得到100 mg/L硝態氮標準中間液。臨用時配制。

（4）制備樣液。在500 mL螺口聚乙烯瓶中加入40.00 g（精確到0.01 g）新鮮土壤樣品，加入200 mL氯化鉀浸提液，旋緊瓶蓋后，在25 ℃下以220r/min的頻率，在恒溫往復式振蕩機中振蕩1 h。吸取約60 mL懸濁液于100 mL聚乙烯離心管中，在3000 r/min的轉速下離心10 min。將約50 mL上清液轉移至50 mL聚乙烯瓶中，待測。

（5）預處理。當土壤樣品試液與空白溶液相比有明顯色差時（試液多呈現黃色調），說明土壤浸出液中的有機物含量較高，應再次稱取約40.00 g該土壤樣品（精確到0.01 g）于500 mL螺口聚乙烯瓶中，依次加入2.00 g活性炭（分析純）和200 mL氯化鉀浸提液，按步驟3.1.1（4）重新制備試液。

（6）空白試驗。加200 mL氯化鉀浸提液于500 mL聚乙烯瓶中，按照與3.1.1（4）相同的試劑和步驟進行制備，每批樣品應制備2個以上空白溶液。

3.1.2 標準曲線

吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00 mL和4.00 mL硝態氮標準中間液于100mL容量瓶中，用氯化鉀浸提液定容，搖勻后得到濃度分別為0.00、0.50、1.00、2.00、3.00 mg/L和4.00 mg/L的硝態氮標準工作液。

于220 nm和275 nm波長處，以空白溶液[3.1.1（6）]為零點，在紫外分光光度計上由低到高逐個測定硝態氮標準工作液的吸光度，計算出校正吸光度。校正吸光度按式（1）計算：

式（1）中：

A為硝態氮標準工作液的校正吸光度；

A220為硝態氮標準工作液在220 nm波長處的吸光度；

A275為硝態氮標準工作液在275 nm波長處的吸光度；

2.23為f值，是測定多種不同類型的土壤得到的經驗性校正因數，得到f平均為2.23。以硝態氮標準工作液的校正吸光度作為縱坐標，對應的硝態氮濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

3.1.3 測定

在220 nm和275 nm波長處，以空白溶液[3.1.1.（6）]為零點，在紫外分光光度計上測定吸光度，測定順序為先測空白溶液，再測樣品試液。計算出校正吸光度，從標準曲線上查出土壤浸出液中的硝態氮含量[1]。

3.2 銨態氮的測定

3.2.1 試劑配制

（1）氯化鉀溶液。稱取氯化鉀（KCl）149.0 g溶于水中，定容至1 L，得到2 mol/L氯化鉀溶液。

（2）苯酚溶液。加水溶解10.0 g苯酚（C6H5OH）和 100 mg硝普鈉 {Na2[Fe(CN)5NO]·2H20}，移至 1 L 容量瓶中，定容。此試劑應現配現用，或在4 ℃保存于棕色瓶中。亞硝基鐵氰化鈉有劇毒，此試劑的使用和廢液的處理應慎重。

（3）次氯酸鈉堿性溶液。稱取10.0 g氫氧化鈉（NaOH）、7.06 g磷酸氫二鈉（Na2HP04·7H20）、31.8 g磷酸鈉（Na3P04·12H20）溶于水中，再加入10 mL次氯酸鈉溶液（NaClO，稱取5.25 g次氯酸鈉溶于100 mL水中），稀釋至1 L，在4 ℃保存于棕色瓶中。

（4）掩蔽劑。稱取40.0 g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H20）溶于100 mL水，再稱取10.0 g EDTA二鈉鹽（C10H14O8N2Na2）溶于100 mL水中，然后將兩種溶液等體積混合。每100 mL混合液中加入0.5 mL 10 mol/L氫氧化鈉。

（5）銨態氮標準溶液。稱取硫酸銨[(NH4)2S04，優級純]0.6 g，在105 ℃烘干2 h，再稱取烘干后的硫酸銨0.471 7 g溶于水中，定容至1 L，制備成含銨態氮的貯存溶液[ρ(NH+4-N)=100 mg/L]；使用前將其加水稀釋40倍，即為銨態氮標準溶液[ρ(NH+4-N)=2.5 mg/L]。

（6）制備樣液。稱取過2 mm篩的新鮮土樣20.00 g于200 mL玻璃瓶中，用100 mL氯化鉀溶液浸提，加塞，放在恒溫往復式振蕩機上振蕩1 h，用干濾紙過濾，如不能在24 h內分析，需置于冰箱中存放。

（7）空白試驗。溶液的制備除不加土樣外，其他步驟同3.2.1（6）。

3.2.2 標準曲線

吸取0.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL和10.00mL銨態氮標準液于50 mL容量瓶中，各加10 mL氯化鉀溶液，標準系列溶液濃度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L和0.50 mg/L，然后加入苯酚溶液5.0 mL和次氯酸鈉堿性溶液5 mL，搖勻。在20 ℃左右的室溫下放置1 h后，加入掩蔽劑1.0 mL溶解可能產生的沉淀物，然后用水定容。在625 nm波長處進行比色，以0.00 mg/L標準溶液為參比溶液調節儀器零點，由低到高測定標準系列待測液的吸收值。

3.2.3 測定

取土壤浸出液5 mL（含NH4+-N 2～25 μg）加入50 mL容量瓶中，用氯化鉀溶液5 mL，然后加入苯酚溶液5.0 mL和次氯酸鈉堿性溶液5.0 mL，搖勻后在20 ℃左右的室溫下放置1h，再加掩蔽劑1.0 mL溶解可能產生的沉淀物，然后用水定容。在625 nm波長處測定待測液空白溶液和待測液的吸光值[4]。

3.3 有效磷的測定

3.3.1 試劑配制

（1）硫酸。H2SO4，ρ=1.84 g/mL。

（2）鹽酸。HCl，ρ=1.19 g/mL。

（3）二硝基酣指示劑。稱取0.20 g 2,4-二硝基酚或2,6-二硝基酚（C6H4N2O5）溶于100 mL水中。

（4）氫氧化鈉溶液。稱取80.0 g氫氧化鈉溶于水，用水定容到1 L，得到2 mol/L氫氧化鈉溶液。

（5）硫酸溶液。吸取28.0mL硫酸，緩緩注入水中，并定容到1 L，得到0.5 mol/L硫酸溶液。

（6）酒石酸銻鉀溶液。稱取酒石酸銻鉀（KSbOC4H4O6·1/2H2O）0.50 g溶于 100 mL 水中，得到5 g/L酒石酸銻鉀溶液。

（7）鉬銻貯存液。稱取153.0 mL硫酸緩緩倒入400 mL水中，攪拌，靜置冷卻。另稱取10.0 g鉬酸銨[(NH4)6Mo7O24·H2O]，溶于 300 mL 60 ℃的水中，靜置冷卻。然后緩緩將硫酸溶液倒入鉬酸銨溶液中，再加入100.0 mL 5g/L酒石酸銻鉀溶液，最后用水稀釋至1 L，搖勻，于4 ℃保存在棕色瓶中。

（8）鉬銻抗顯色劑。稱取1.50 g抗壞血酸（C6H8O6，左旋，旋光度+21°～+22°）溶于100 mL鉬銻貯存液中，此液需現配現用。

（9）磷標準儲備液。稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4，優級純）0.6 g，于105 ℃烘干2h后，稱取烘干后的磷酸二氫鉀0.439 4 g，用水溶解，加5 mL硫酸，用水定容到1 L，得到100 mg/L磷標準儲備液。

（10）磷標準溶液。吸取5.00 mL磷標準儲備液于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到5 mg/L磷標準溶液此溶液需現配現用。

（11）無磷活性炭。如果所用活性炭含磷，應該先用1∶1鹽酸溶液浸泡12 h以上，然后移放到平板漏斗上抽氣過濾，用水淋洗4～5次，再用42 g/L碳酸氫鈉溶液浸泡12 h以上，在平板漏斗上抽氣過濾，用水洗盡碳酸氫鈉，烘干備用。

3.3.2 鹽酸-硫酸浸提

（1）鹽酸-硫酸浸提劑。吸取4.0 mL鹽酸、0.7 mL硫酸于有水的1 L容量瓶中，用水定容至刻度，此溶液含0.05 mol/L HC1和0.025 mol/L H2S04。

（2）制備樣液。稱取過2 mm篩的風干土樣5.00 g于浸提瓶中，加25.0 mL雙酸浸提劑，在20～25 ℃恒溫條件下160 r/min振蕩5 min，過濾，待測液供測有效磷用（如濾液顏色過深，影響比色時，則需加無磷活性碳進行脫色處理。

（3）空白溶液的制備。空白溶液的制備除不加土樣外，其他步驟同3.3.2（2）。

（4）標準曲線。分別吸取 5 mg/L磷標準溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 和 6.00 mL于50 mL容量瓶中，再分別加入5 mL鹽酸-硫酸浸提劑，1滴二硝基酚指示劑，然后用2 mol/L氫氧化鈉溶液調節溶液顏色到黃色，用0.5 mol/L硫酸溶液調pH到溶液剛呈微黃色，加入5.0 mL鉬銻抗顯色劑，用水定容，搖勻，即得 0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L和0.60 mg/L磷標準系列顯色液。在室溫高于20 ℃條件下靜置30 min，在分光光度計上用700 nm波長比色，以0.00 mg/L標準溶液為參比溶液調節儀器零點，由低到高測定標準系溶液的吸收值，繪制標準曲線。

3.3.3 測定

分別吸取空白溶液和待測液5 mL于50 mL容量瓶中，加1滴二硝基酚指示劑，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調節溶液顏色到黃色，然后用0.5 mol/L硫酸溶液調pH到溶液剛呈微黃色，加入5.0 mL鉬銻抗顯色劑，用水定容，搖勻，在室溫高于20 ℃條件下靜置30 min，在分光光度計上用700 nm波長比色，獲得空白溶液和待測液的磷濃度（mg/L）[3]。

3.4 有效鉀的測定

3.4.1 試劑配制

（1）硝酸浸提劑。取濃硝酸（HNO3，約16 mol/L，ρ≈1.42 g/mL，分析純）125 mL，加水稀釋至1 L，得到2 mol/L硝酸溶液。

（2）氯化鈉溶液。準確稱取1 g氯化鈉至100 mL容量瓶中，加入蒸餾水攪拌均勻，定容至 100 mL， 即得到濃度為10 g/ L的氯化鈉溶液。

（3）氯化鉀標準溶液。稱0.191 2 g氯化鉀，加水溶解，定容至100 mL，配制成1 g/L的濃溶液。再移取10 mL濃溶液，加水稀釋至100 mL，配制成100 mg/L的鉀貯備液，分別移取一定體積的貯備液加水稀釋至100 mL，得到一系列不同濃度的鉀標準工作液。

（4）配制樣液。將土樣自然風干后，用研缽把風干的土樣研碎，然后再用100目的篩子（孔徑約149 μm進行篩分。稱取通過149 μm篩孔的風干土樣3份，質量約2.500 g于干250 mL錐形瓶中，加入50 mL 2 mol/L HNO3，室溫下于振蕩器往返振蕩0.5 h，靜止30 min后用定量濾紙過濾，濾液轉移到50 mL離心管中。

3.4.2 標準曲線

在6個100 mL容量瓶中，各加入10.00 mL 10g/L氯化鈉溶液和20.00 mL 2 mol/L 硝酸溶液，然后從第二個起分別加入鉀標準工作液1.00、2.00、3.00、4.00 mL和5.00 mL，用水定容至刻度線，搖勻，此時加入的鉀標液濃度依次為0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mg/L和5.00 mg/L，然后分別測各溶液的吸光度，記錄讀數，制作標準作曲線。

3.4.3 測定

分別移取3.4.1（4）所得到的濾液2 mL至10 mL離心管中，各加入1 mL 10 g/L NaCl和7 mL水，搖勻，每個樣品都做好標記，同鉀標準系列溶液一起測定。記錄數據，然后從標準曲線上求得其濃度[2]。

4 結果與分析

4.1 硝態氮的測定結果與分析

4.1.1 硝態氮標準曲線的繪制

由圖1和表1可知，土壤浸出液中硝酸根離子在220 nm波長有明顯吸收且吸光度大小與硝酸根離子濃度成正比。然后溶解的有機物在220 nm和275 nm波長處均有吸收， 而硝酸根離子在275 nm波長處沒有吸收，測定土壤浸出液在275 nm處的吸光度，乘以一個校正因數（f值）就可以以消除有機質吸收220 nm波長而造成的干擾，得出校正吸光度。

表1 硝態氮標準工作液在220 nm和275 nm波長處吸光度

圖1 硝態氮標準曲線

4.1.2 硝態氮樣品的測定結果

表2 硝態氮樣本溶液在220 nm和275 nm波長處吸光度sss

4.1.3 結果計算

（1）計算方法

土壤硝態氮含量以質量分數WN計，數值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（2）計算：

式中：ρN為從校準曲線上查得土壤樣品試液的硝態氮濃度，單位為mg/L；ρO為從校準曲線上查得空白試液的硝態氮濃度，單位為mg/L；R為試樣體積（包括浸提液體積與土壤中水分的體積）與烘干土的比例系數，單位為mL/g，按照式（3）～（5）進行計算。

式中：R1為浸提液體積與烘干土的比例系數，單位為mL/g；R2為土壤水分體積與烘干土的比例系數，單位為mL/g；V為浸提液體積，單位為mL；m為稱取的新鮮土壤樣品質量，單位為g；Ww為以烘干土計的土壤水分的質量分數，%；dw為試驗室所處溫度下水的密度，單位為g/cm3，取1.00 g/cm3。

當土壤硝態氮含量的測定結果小于1 mg/kg時，保留兩位有效數字；當測定結果大于或等于1 mg/kg時，保留三位有效數字。

（2）樣品計算

4.2 銨態氮的測定結果與分析

4.2.1 銨態氮標準曲線的繪制

表3 銨態氮標準工作液在625 nm波長處吸光度

圖2 銨態氮標準曲線

由表3和圖2可知，土壤浸提液中的銨態氮在強堿性介質中與次氯酸鹽和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚藍。在625nm波長處吸光度與銨態氮含量成正比。

4.2.2 銨態氮樣品的測定結果

表4 銨態氮樣本溶液在625nm波長處吸光度

4.2.3 結果計算

（1）計算方法

土壤銨態氮含量以質量分數WN計，數值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（6）計算：

式中：WN為銨態氮（NH3--N）含量，單位為mg/kg；c為由標準曲線上獲得的待測液中的銨態氮的濃度，單位為mg/L；c0為由標準曲線上獲得的空白溶液的銨態氮的濃度，單位為mg/L；V為顯色液的體積，單位為mL；m為新鮮土樣質量，單位為g；k為將新鮮土樣換算成烘干土樣的水分換算系數。

（2）樣品計算

4.3 有效磷的測定結果與分析

4.3.1 有效磷標準曲線的繪制

表5 有效磷標準溶液在700nm波長處吸光度

圖3 有效磷標準曲線

由表5和圖3可知，正磷酸根和鉬酸銨溶液在酸性環境中反應，生成 [H3P(Mo3O10)]， 用抗壞血酸在鉬銻試劑的作用下將磷鉬雜多酸絡合物還原生成藍色的絡合物，在700nm波長處的吸光度與有效磷的含量成正比。

4.3.2 有效磷樣品的測定結果

表6 有效磷樣本溶液在700 nm波長處吸光度

4.3.3 結果計算

（1）計算方法

土壤有效磷含量以質量分數WP計，數值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（7）計算：

式中：Wp為有效磷（P）含量，單位為mg/kg；c為由標準曲線上獲得的待測液的磷濃度，單位為mg/L；c0為由標準曲線上獲得的空白溶液的磷濃度，單位為mg/L；V為顯色液的體積，取50 mL；m為風干土樣質量，單位為g；k為將風干土樣換算成烘干土樣的水分換算系數。

（2）樣品計算

4.4 有效鉀的測定結果與分析

4.4.1 有效鉀標準曲線的繪制

表7 有效鉀標準溶液吸光度

圖4 有效鉀標準曲線

由表7和圖4可知，以2 mol/L的硝酸溶液作為浸提劑，將土壤與試劑以20：1的比例混合后，在恒溫往復式震蕩機中震蕩半小時后過濾，溶液中的鉀離子用火焰光度計測定，鉀離子含量與吸光度成正比。

4.4.2 有效鉀樣品的測定結果

表8 有效鉀樣本溶液吸光度

4.4.3 結果計算

（1）計算方法

土壤有效鉀含量以質量分數WK計，數值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（8）計算：

式中：WK為有效鉀（K）含量，單位為mg/kg；c為由標準曲線上獲得的待測液的有效鉀的濃度，單位為mg/L；c0為由標準曲線上獲得的空白溶液的有效鉀的濃度，單位為mg/L；V為浸提劑體積，取50 mL；m為風干土樣質量，單位為g；k為將風干土樣換算成烘干土樣的水分換算系數[12]。

（2）樣品計算

5 討論

本次試驗得出的數據與參考文獻中所得數據比起來，硝態氮、銨態氮和有效磷含量相差不大，有效鉀含量偏大。有效鉀含量偏高可能是試驗過程中稱量土樣不精準和試驗用水中有鉀離子存在所致。

本試驗用氯化鉀浸提硝態氮的方法代替用飽和硫酸鈣浸提，省去了蒸干浸提液，用酚二磺酸處理殘渣必須在無水條件下才能迅速反應完成。且還需向蒸干物中加1:1的氨水至溶液呈微堿性，即溶液為黃色。本試驗的過程簡化許多，只用注意浸提液離心后，若液體顏色過深，可用活性炭沉降除雜。

本試驗用氯化鉀浸提銨態氮，苯酚溶液和次氯酸鈉堿性溶液顯色，并用遮掩劑溶解沉淀，雖然過程比奈氏試劑法復雜了一些，但是奈氏試劑法只能測定濃度最低0.025mg/L最高2mg/L，可能對樣品土壤不適用。

對有效磷使用雙酸浸提適用于質地較輕的酸性森林土壤，與樣品土壤所處環境較為接近。

用硝酸浸提有效鉀代替乙酸銨浸提，是因為若加入乙酸銨溶液放置過久，部分礦物鉀會轉入溶液中，使有效鉀量偏高影響試驗結果。

6 結論

土壤樣品中，硝態氮含量12.23 mg/kg、銨態氮含量9.82 mg/kg、有效磷含量116.72mg/kg、有效鉀含量511.78 mg/kg。

本試驗用1 mol/L氯化鉀溶液浸提硝態氮，在220 nm和275 nm波長處比色。以2 mol/L氯化鉀浸提銨態氮，用苯酚溶液和次氯酸鈉堿性溶液與浸出液中的銨態氮反應，生成靛酚藍水溶性染料，在625 nm波長處測吸光度。使用鹽酸-硫酸浸提土壤中的有效磷，正磷酸根和鉬酸銨反應生成磷鉬雜多酸絡合物[H3P(Mo3O10)]，在鉬銻試劑的作用下，用抗壞血酸將其還原生成藍色的絡合物再進行比色。浸提有效鉀是以2 mol/L的硝酸溶液作為浸提劑與土壤混合過濾后，溶液中鉀用火焰光度計測定。與現行的測量方法相比，本文中的方法簡便一些，更加易于操作，滿足了快速檢驗的要求。但對于全國各地的各種土質是否都能快速準確的檢驗仍待進一步研究。