涂招秀，謝欣，胡居吾＊，黃斌華

（1.江西省科學院，江西南昌 330096；2.江西華紫仁農業開發有限公司，江西贛州 330000）

蔓三七，又名平臥菊三七、蛇接骨、續命草、神仙草，味辛、微苦、性涼，為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營養豐富，富含粗多糖和綠原酸，同時還含有總黃酮、維生素A、維生素C、氨基酸和有機鈣等成分。民間利用其通經活絡，消腫止痛，消炎止咳，治療跌打損傷，支氣管肺炎、肺結核等[1]。現代生物化學和醫學研究證明，蔓三七具有通經活絡、消炎止咳、散淤消腫、活血生肌等功效[2]，能延緩衰老、激活免疫細胞、改善機體免疫功能、提高人體免疫力，增強人體的新陳代謝并對記憶障礙有一定改善作用[3]；具有降血壓、降血糖和預防慢性腎病、抑制乙型肝炎的顯著效果[4]；對預防和治療心腦血管疾病、糖尿病等有一定的療效[5]；還具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志賀樣毒素細胞的活性[6]。

動態超高壓微射流技術是一種新興的超微細化技術[7]，目前常被用于滅菌作用[8]、多糖的提取[9]、蛋白質改性[10]等。運用動態超高壓微射流技術來提取黃酮的研究相對較少。

本實驗采用正交實驗優化動態超高壓微射流技術提取蔓三七葉中黃酮的最佳工藝參數，以達到提高蔓三七葉中黃酮的得率為目的，為全面開發和利用蔓三七提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓三七，江西華紫仁農業開發有限公司，烘干、粉碎后過20目篩備用。蘆丁標準品，中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；其余試劑，均為國產分析純。

MFIC高壓微射流均質機（M-700 Series），美國Microfluidics公司生產；高壓均質機（GY50-6S），上海華東高壓均質機廠生產；可見分光光度計（722G），上海馳唐實業有限公司生產；電子分析天平（AL104），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

精確稱取在120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品0.2000 g，置于100 mL容量瓶中，加80%乙醇70 mL，置于水浴上微熱使溶解，冷卻至室溫，加乙醇至刻度，搖勻。精密吸取10 mL置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液。

精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL和7.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加乙醇6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，后加5%氫氧化鈉試液10.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以乙醇為參比，用1 mL比色皿，于紫外可見分光光度計上，在400～600 nm波長處進行掃描。結果表明，對照品溶液在510 nm處有最大吸收，因此選擇510 nm作為測定波長。在510 nm波長處測定體系的吸收度，以吸收度（A）為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 蔓三七葉黃酮提取的流程

蔓三七葉粉末→一定濃度的乙醇浸泡→過夜→高壓預均質（30 MPa，2次）→動態超高壓微射流均質→乙醇冷凝回流提取（70 ℃，2次）→合并提取液→離心→抽濾→測定吸光度→計算黃酮得率。

1.2.3 蔓三七葉黃酮得率的計算

取0.5mL提取液，按照1.2.1的方法測定其在510 nm下的吸光度，按照式（1）計算黃酮的得率。

1.2.4 單因素實驗

本實驗中，提取溫度、乙醇濃度、提取時間、提取次數、微射流均質壓力、料液比等因素為影響蔓三七葉黃酮得率的主要因素。通過前期研究，確定液料比為15:1（mL: g），提取次數為2次。本實驗主要研究提取溫度、乙醇濃度、提取時間和微射流均質壓力四個因素對蔓三七葉黃酮得率的影響。

1.2.5 正交實驗設計

根據上述單因素的實驗研究結果發現，乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、微射流均質壓力（D）對蔓三七葉黃酮得率影響較大。因此，采用四因素三水平的正交試驗方法對工藝條件進行優化，以類蔓三七葉黃酮得率為評價指標，設計方案見表1。

表1 正交實驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線回歸方程為A=5.8579C+0.0012，R2=0.9996，在0～0.05 mg/mL范圍內其吸光度值與濃度呈良好的線性關系。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g干燥的蔓三七葉粉末（過20目），液料比15:1 (ml:g)，加入分別為50%、60%、70%、80%和90%濃度的乙醇，浸泡過夜，先經過30 MPa預均質后，在80 MPa微射流壓力下處理2次，65℃水浴提取1.5 h，提取兩次，結果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對黃酮得率的影響

由圖1可知，在乙醇濃度為50%～70%范圍內，蔓三七葉黃酮得率隨著乙醇濃度的增加而增大，并且在乙醇濃度為70%時達到最大值，此時得率為1.93%；在乙醇濃度為70%～90%范圍內，乙醇濃度繼續上升，黃酮得率緩慢下降，在乙醇濃度為90%時，蔓三七葉黃酮得率為1.82%。蔓三七葉黃酮得率隨著乙醇濃度的上升而下降，主要是因為當體系中的乙醇濃度大于70%后，物料中脂溶性雜質（如葉綠素）等大量溶解到體系中，從而降低了蔓三七葉黃酮的得率。因此，選擇乙醇濃度為70%較合適。

2.2.2 提取溫度對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15:1(ml:g)加入70%濃度的乙醇，浸泡過夜，經30 MPa預均質后，立刻在80 MPa微射流壓力下處理2次，提取溫度選擇50、55、60、65 ℃和70 ℃水浴提取1.5 h，提取兩次，結果如圖2所示。

由圖2可知，在提取溫度為50～65 ℃范圍內，蔓三七葉黃酮得率隨著提取溫度的上升而增加，且能顯著影響蔓三七葉黃酮得率。在提取溫度為50 ℃時，蔓三七葉黃酮得率為1.61%，而在提取溫度為65℃時，蔓三七葉黃酮得率達到1.92%。但當溫度超過65 ℃后，蔓三七葉黃酮得率隨著溫度的上升而緩慢下降，在提取溫度為70 ℃時，蔓三七葉黃酮得率為1.87%，由于在高溫下蔓三七葉黃酮中的某些在高溫下易分解的活性成分被氧化分解，因此，用蘆丁做標準品去測量產品中的蔓三七葉黃酮含量下降，從而影響了其得率。因此，選擇提取溫度為65 ℃較合適。

2.2.3 提取時間對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15:1 (mL:g)加入70%濃度的乙醇，浸泡過夜，經30 MPa預均質后，立刻在80 MPa微射流壓力下處理2次，提取溫度65 ℃水浴提取，提取時間選擇0.5、1、1.5、2 h和2.5 h，提取兩次，結果如圖3所示。

由圖3可知，蔓三七葉黃酮得率隨著時間的延長先增加而后趨于平緩，在1.5 h內時，黃酮得率升高較快，而超過1.5 h后，黃酮得率變化不大。因此，選擇提取時間為1.5 h較合適。

圖2 提取溫度對黃酮得率的影響

圖3 提取時間對黃酮得率的影響

2.2.4 微射流均質壓力對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15:1 (mL:g)加入70%濃度的乙醇，浸泡過夜，經30 MPa預均質后，分別在立刻微射流均質壓力選擇60、70、80、90 MPa和100 MPa下處理2次，提取溫度65℃水浴提取1.5 h，提取兩次，結果如圖4所示。從圖4可知，在微射流均質壓力為60～90 MPa范圍內，蔓三七葉黃酮得率隨著微射流均質壓力的增大而增加，在壓力為90 MPa時達到最大值，得率達到1.94%。而后隨著均質壓力的進一步加大，蔓三七葉黃酮得率趨于平緩且略微下降。微射流均質后再提取時，使得蔓三七葉黃酮得率隨著均質壓力的上升而顯著提高，其原因是均質壓力越大，使得物料的細胞破碎程度越高，從而使得物料中有效成分黃酮類物質更完全地溶出。

圖4 微射流均質壓力對黃酮得率的影響

2.3 正交實驗的結果與分析

從表2比較4個因素的極差R值，RA＞RC＞RB＞RA，即乙醇濃度＞提取時間＞提取溫度＞壓力，說明因素A對指標的影響最大。根據K值實驗結果可見，最佳工藝組合為A3B2C3D2，即乙醇濃度80%、提取溫度65 ℃、提取時間2.0 h、壓力80 MPa。依照優化條件進行重復試驗，此時蔓三七葉黃酮的得率為1.95%，提取率為94.8%。

表2 正交實驗設計及結果

3 結論

本實驗研究了動態超高壓微射流對蔓三七葉黃酮得率的影響。通過正交實驗法確定了微射流均質熱醇提取蔓三七葉黃酮的最佳條件：乙醇濃度80%、提取溫度65 ℃、提取時間2.0 h、微射流均質壓力80 MPa、微射流均質次數2次、液料比15:1 (ml:g)、提取次數2次。此時，蔓三七葉黃酮的得率為1.95%。