老年散發(fā)性結(jié)直腸癌中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性

張良良， 宋 蒨，石紅建，任景麗，卞曉星

近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率與死亡率上升至第3位和第4位[1]。結(jié)直腸癌總數(shù)的95%[2]左右為散發(fā)性結(jié)直腸癌(sporadic colorectal carcinoma,SCC)。SCC中15%是由錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)蛋白表達(dá)缺失而引起的[3]。MMR基因的功能在于維持基因復(fù)制的準(zhǔn)確性，翻譯正常的錯(cuò)配修復(fù)蛋白，發(fā)揮抗腫瘤作用，如其發(fā)生突變或甲基化，致癌基因?qū)⒌玫骄奂瑢?dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。隨著人口老齡化，老年SCC患者不斷增多，且SCC患者中現(xiàn)仍以老年人為主[5]，但MMR在老年SCC中的研究則較少，老年SCC患者中MMR的具體作用需要進(jìn)一步的分析研究。基于此，該研究將探討老年SCC患者中MMR蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性，旨在為老年SCC患者的診療及對預(yù)后的估計(jì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例資料篩選從2009年6月～2012年6月江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院病理科SCC術(shù)后的標(biāo)本，共232例，分為老年組152例(年齡≥65歲)，非老年組80例(年齡<65歲)。老年組患者年齡65～86(73.71±7.63)歲，非老年組患者年齡30～59(46.8±8.56)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：① 所有患者具有完整的臨床信息；② 術(shù)前均未進(jìn)行放、化療；③ 均經(jīng)術(shù)前及術(shù)后病理檢查，明確診斷為SCC；④ 分期均為Ⅱ-Ⅲ期，分期符合美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)第七版分期標(biāo)準(zhǔn)[6]。其中Ⅱ期結(jié)腸癌患者包括以下至少一項(xiàng)高危因素：組織學(xué)分化差﹙Ⅲ或Ⅳ級)、標(biāo)本檢出淋巴結(jié)不足(少于12枚)、T4、脈管浸潤、術(shù)前腸梗阻或腸穿孔；⑤ 化療方案均應(yīng)用FOLFOX方案。

1.2方法在MMR系統(tǒng)中，MMR基因主要依賴hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白發(fā)揮作用[7]，因此采用免疫組織化學(xué)方法測定上述蛋白的表達(dá)情況。步驟：將標(biāo)本用40 g/L的甲醛固定，石蠟包埋，按5 μm的厚度連續(xù)切片，用PV-9000二步法，常規(guī)HE染色，于組織細(xì)胞狀態(tài)較好處，用免疫組織化學(xué)法染色，一抗為hMLH1、hMSH2、hMSH6鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物有限公司)，陰性對照以磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照。以正常結(jié)直腸黏膜上皮或浸潤的淋巴細(xì)胞為陽性對照。

1.3結(jié)果判定結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：① 按將陽性細(xì)胞所占的比例進(jìn)行評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分；② 將染色程度進(jìn)行評分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無色為0分；染色程度評分和陽性細(xì)胞的比例評分的乘積≥2分，判定為MMR蛋白表達(dá)正常，<2分判定為表達(dá)缺失。以正常的結(jié)直腸黏膜上皮核染色作陽性對照。hMLH1、hMSH2、hMSH6均表達(dá)正常判定為表達(dá)正常(proficient mismatch repair，pMMR)，否則判定為表達(dá)缺失(deficient mismatch repair，dMMR)。

1.4隨訪每3～6個(gè)月對患者進(jìn)行一次隨訪；隨訪內(nèi)容包括：治療方案、是否復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)時(shí)間、生存時(shí)間等。隨訪截至日期為2017年6月，隨訪時(shí)間為11～60個(gè)月。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0軟件對資料進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法對生存時(shí)間曲線進(jìn)行繪制，并以Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。單因素及多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MMR蛋白的表達(dá)情況老年組共有26例MMR蛋白表達(dá)缺失，缺失率為17.71%(26/152)；非老年組共有21例MMR蛋白表達(dá)缺失，缺失率為26.25%(21/80)，兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.100)。見圖1。

圖1 MMR蛋白免疫組織化學(xué)圖 ×100A：hMLH1蛋白；B：hMSH2蛋白；C：hMSH6蛋白；1：表達(dá)正常；2：表達(dá)缺失

2.2MMR蛋白表達(dá)與SCC患者臨床病理特征的關(guān)系老年組：dMMR組患者和pMMR組患者在分期、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與pMMR組相比，dMMR組患者更多見于高分化、Ⅱ期、腫瘤直徑≥5 cm的患者，更難發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。非老年組：dMMR組患者和pMMR組患者在分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與pMMR組相比，dMMR組患者更多見于高分化、Ⅱ期的患者，更難發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見表1。

2.3MMR表達(dá)與SCC患者預(yù)后的關(guān)系老年組：dMMR組的5年生存率為84.62%(22/26)，高于pMMR組56.35%(71/126)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.001，P=0.003)。非老年組：dMMR組的5年生存率為80.95%(17/21)，高于pMMR組49.15%(29/59)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.991，P=0.008)。見圖2。

2.4單因素和多因素分析單因素分析結(jié)果顯示：

表1 MMR表達(dá)缺失組和MMR表達(dá)正常組患者臨床病理特征比較(n)

圖2 SCC患者dMMR組與pMMR組生存時(shí)間比較A:老年組；B:非老年組

表2 影響患者生存時(shí)間的單因素 COX 回歸分析結(jié)果

RR：相對危險(xiǎn)度

表3 老年組生存時(shí)間的多因素 COX 回歸分析結(jié)果

RR：相對危險(xiǎn)度

表4 非老年組生存時(shí)間的多因素 COX 回歸分析結(jié)果

RR：相對危險(xiǎn)度

MMR狀態(tài)、腫瘤分化程度、組織學(xué)類型與老年組和非老年組患者預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.05)。多因素分析結(jié)果顯示：MMR狀態(tài)、分化程度為影響老年組患者生存時(shí)間的獨(dú)立因素(P<0.05)；MMR狀態(tài)、組織學(xué)類型為影響非老年組患者生存時(shí)間的獨(dú)立因素(P<0.05)。見表2～4。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率呈逐漸上升的趨勢，其中MMR基因的突變或甲基化導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生，這一途徑越來越受到重視。MMR基因的正常表達(dá)，可識別并糾正錯(cuò)配的堿基，保持基因轉(zhuǎn)錄翻譯的穩(wěn)定性，避免腫瘤的發(fā)生[8]。隨著人口老齡化和醫(yī)療水平的提高，老年SCC患者的數(shù)量越來越多，研究MMR在老年SCC患者中的作用顯得非常重要。老年組MMR蛋白表達(dá)缺失率為17.71%，低于非老年組的26.25%，或許是因?yàn)榉抢夏杲M樣本量較少的原因，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可反映這有可能是SCC患者年輕化趨勢的原因之一。相關(guān)研究[9]表明，MMR蛋白的表達(dá)狀態(tài)與SCC患者的臨床病理特征有明顯的相關(guān)性。本研究顯示，在老年SCC患者中，dMMR組患者更多見于Ⅱ期、高分化、腫瘤直徑≥5 cm的患者，更難發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。dMMR組的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例要比pMMR組低，這與Park et al[10]的研究結(jié)果一致，這或許是dMMR組患者預(yù)后較好的原因之一。

與pMMR組患者相比，dMMR組患者更多為Ⅱ期、高分化的腫瘤，早期及高分化的腫瘤，預(yù)后往往較好，這些均可能是dMMR組患者預(yù)后更好的原因。dMMR組患者更多為體積較大的腫瘤(直徑≥5 cm)，這些患者由于腫瘤體積較大，發(fā)生腹痛、排便習(xí)慣改變等臨床癥狀和腸穿孔、腸梗阻、出血等并發(fā)癥的時(shí)間較早，更早地發(fā)現(xiàn)、及時(shí)治療意味著更好的預(yù)后。對于非老年組患者，MMR表達(dá)狀態(tài)與患者的分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面顯著相關(guān)，與腫瘤直徑無明顯相關(guān)性，這與老年組患者不同。研究[11]表明，MMR蛋白與SCC患者的生存時(shí)間有明顯的相關(guān)性。Zaanan et al[12]認(rèn)為，dMMR患者的生存時(shí)間顯著長于pMMR患者，F(xiàn)OLFOX輔助化療有益于dMMR患者。也有一些學(xué)者認(rèn)為，含5-Fu的化療方案對dMMR患者無明顯的作用[13]。本研究顯示，MMR蛋白表達(dá)缺失是老年SCC患者預(yù)后好的指標(biāo)，Cox回歸分析結(jié)果表明：MMR狀態(tài)為影響SCC患者生存時(shí)間的獨(dú)立因素。兩組患者均于術(shù)后應(yīng)用FOLFOX方案進(jìn)行化療，結(jié)果dMMR組的5年生存率高于pMMR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，對于伴有高危因素的老年Ⅱ-Ⅲ期SCC中MMR表達(dá)缺失的患者，建議應(yīng)進(jìn)行術(shù)后輔助化療。對于MMR影響SCC患者預(yù)后的具體機(jī)制，仍未完全闡明，有多種觀點(diǎn)。Scarpa et al[14]認(rèn)為，相比MMR蛋白表達(dá)正常的SCC患者，MMR蛋白表達(dá)缺失的SCC患者中，免疫監(jiān)視功能明顯增強(qiáng)，可顯著影響患者的預(yù)后。Zhang et al[15]則認(rèn)為dMMR結(jié)直腸癌的免疫微環(huán)境與pMMR的不同。

本研究未將MMR蛋白表達(dá)狀態(tài)分別與Ⅱ期、Ⅲ期SCC患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行研究，有待大規(guī)模、更為細(xì)致的研究驗(yàn)證上述結(jié)論。

綜上所述，老年SCC患者M(jìn)MR蛋白的表達(dá)狀態(tài)與其臨床病理特征及預(yù)后有明顯的相關(guān)性，dMMR組患者更多見于Ⅱ期、高分化、腫瘤直徑≥5cm的患者，更難發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。MMR狀態(tài)為影響老年SCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素，dMMR組患者較pMMR組患者預(yù)后更好。