小鼠第一極體基因組移植的時間窗探索

袁 錦，紀冬梅，鄒薇薇，武龍梅，章志國，曹云霞

近年來隨著哺乳動物核移植技術的發展和完善，人們對極體功能的探究也逐步深入[1-2]。1998年至今，科學家先后以小鼠、豬和人為研究模型，證實第一極體染色體具有參與胚胎發育的能力，確認了第一極體基因組移植的可行性[3-6]，認為其在卵子缺陷所致的不孕不育治療、線粒體遺傳病治療等方面具有較為廣泛的再利用價值[7-9]。但對第一極體應用效率尚未深入探究。該研究旨在探討第一極體從剛排出到趨于退化過程中，各個時間段的小鼠第一極體是否都可以參與構建重構卵子并重獲正常受精和發育的能力；同時篩選出第一極體基因組移植的最佳時間窗。為深入挖掘哺乳動物第一極體生殖潛力，提高第一極體再利用效率提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物 清潔級BDF1雜交鼠共20只，6～8周齡，體質量20～28 g，購自南京大學南京生物醫藥研究院。

1.1.2試劑和耗材 Gamete培養液(脫除顆粒細胞后洗滌卵子和顯微操作液所需)、Fertilization培養液、Cleavage培養液(受精卵的體外培養所需)均購自澳大利亞COOK公司。細胞松弛素B(cytochalasin B,CB)(取出紡錘體染色體復合物前處理卵子所需)、透明質酸酶(脫除卵丘卵母細胞復合物的顆粒細胞所需)均購自美國Sigma公司。7%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)(顯微操作液所需)購自美國Sage公司。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)(超促排卵所需)均購自寧波第二激素廠。

1.2實驗方法

1.2.1超促排卵 將BDF1雌鼠隨機分組，供核組小鼠均于20:00注射PMSG(7.5 IU/只)，間隔48 h后注射hCG(7.5 IU/只)。供胞質組小鼠分別于18：30、19：30、20：30、21：30注射PMSG(7.5 IU/只)，間隔48 h后分別注射hCG(7.5 IU/只)。

1.2.2MII卵母細胞的采集 核供體MII卵子的獲取：頸椎脫臼法分別處死hCG后12.5、13.5、14.5、15.5 h的4組F1雌鼠，手術剪下輸卵管置于gamete液滴中，體視鏡下用尖鑷子撕開輸卵管壺腹部，獲取卵丘卵母細胞復合物，將卵冠丘復合物置于透明質酸酶中，37 ℃消化3 min，用移卵針輕輕吹吸脫除顆粒細胞，獲取MII裸卵。將MII裸卵置于gamete液滴中洗滌5次洗去透明質酸酶，移入cleavage液滴中，置37 ℃、5% CO2培養箱中備用。

胞質供體MII卵子的獲取：頸椎脫臼法處死hCG后14 h的F1母鼠，以上述相同的方法獲取MII卵子備用。

1.2.3胞質供體卵子去核 將供胞質的卵子移入含5 μg/ml CB的gamete操作液滴中,置于37 ℃恒溫板上，處理10 min，將紡錘體區域調整至3點鐘方向后，用持卵針固定卵子，使用激光破膜儀在3點鐘位置給透明帶打孔。用內徑10 μm的去核針通過透明帶破口，輕輕吸出紡錘體棄去。收集去核后的卵子備用。

1.2.4第一極體的獲取 將供核的卵子移入gamete操作皿中，置于37 ℃恒溫板上，調整至極體位于12點鐘方向，用持卵針固定卵子，使用激光破膜儀在2點鐘位置給透明帶打孔，用內徑8 μm的注射針吸取第一極體備用。

1.2.5卵母細胞的重組 將注射針中的極體輕輕吹出吸回，以確定極體包膜已破，注射針通過3點鐘方向的透明帶破口，將第一極體注入已去核的胞質供體卵子內，輕輕退針，獲得第一極體基因組移植重構卵子。將重構卵子移入cleavage培養皿，置37 ℃、5% CO2培養箱中恢復。

1.2.6重構卵子的體外受精和培養 從F1公鼠附睪尾和輸精管中獲取精子，移入fertilization培養皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中進行獲能。精子獲能大于1 h后，向預先準備好的各個體外受精液滴中加入適量精子，分別移入各組重構卵。5 h后觀察受精情況。洗脫精子后移入cleavage培養皿，置37 ℃、5% CO2培養箱中進行后續培養。

1.2.7對照組卵子的體外受精和培養 獲取MII卵子，脫除顆粒細胞后移入fertilization培養液滴中，加入適量源自F1公鼠的已獲能的精子。5 h后觀察受精情況。洗脫精子后移入cleavage培養皿，置37 ℃、5% CO2培養箱中進行后續培養。

1.3統計學處理數據經Prism 6.0 (GraphPad)軟件處理，重構胚存活率、受精率、2細胞形成率、4細胞形成率和囊胚率的比較均使用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同時間PB1T重構胚制備成功率和體外受精情況根據表1、圖1A和圖2可見，hCG后12.5、13.5、14.5、15.5 h的卵子排出的第一極體作為核供體，PB1T重構胚存活率與對照組(100.0%)比，差異無統計學意義(88.0%、92.0%、92.3%、89.3%，P>0.05)，其中13.5 h和14.5 h組存活率高于其他實驗組。根據表1和圖1B可見，12.5、13.5、14.5 h組體外受精率和對照組(87.5%)比較，差異無統計學意義(81.8%、91.3%、83.3%,P>0.05)，其中13.5 h組體外受精率在實驗組中最高。15.5 h組重構卵子的體外受精率為76%，在實驗組中最低，與對照組比較差異有統計學意義(P=0.020 0)。

2.2不同時間第一極體移植重構胚體外發育情況根據表1和圖1C、D、E可見，13.5 h組重構胚的2細胞、4細胞以及囊胚形成率分別為95.2%、95.0%和84.2%，在實驗組中均最高。與對照組(100%)相比，差異無統計學意義(P>0.05)。12.5 h組重構胚的2細胞、4細胞以及囊胚形成率為83.3%、80.0%、75%,14.5 h組重構胚的2細胞、4細胞以及囊胚形成率為85.0%、88.2%、73.3%，這兩組與對照組相比(100.0%、95.2%、90.0%)，差異無統計學意義(P>0.05)。15.5 h組重構胚的2細胞和4細胞形成率為89.5%和70.6%，與其他組相比，差異無統計學意義。其囊胚形成率為41.7%，在實驗組中最低，與對照組相比，差異有統計學意義(P=0.005 7)。

表1 重構胚的體外受精和發育情況 [n(%)]

與對照組比較：*P<0.05**P<0.01

圖1 不同時間PB1T重構胚的體外存活和發育情況

A：不同時間PB1T重構胚的存活率(存活數/卵子數)；B：不同時間PB1T重構胚的體外受精率(受精數/存活數)；C：不同時間PB1T重構胚的2細胞形成率(2細胞數/受精數)；D：不同時間PB1T重構胚的4細胞形成率(4細胞數/2細胞數)；E：不同時間PB1T重構胚的囊胚率(囊胚數/4細胞數)；與對照組比較：*P<0.05**P<0.01

圖2 第一極體基因組移植重構胚發育圖 ×200A：重構受精卵；B：重構胚分裂為2細胞；C：重構胚分裂為4細胞；D：重構胚發育成囊胚

2.3不同時間第一極體形態變化如圖3所示，hCG后12.5 h大多卵子剛開始排出的第一極體，此時間點第一極體呈扁橢圓體，邊界清晰，沒有與卵胞質完全分離。如圖4A所示，部分第一極體中的染色體與胞質中染色體沒有徹底分離。hCG后13.5 h時，第一極體與卵胞質完全分離。呈較為飽滿的橢圓體，邊界清晰。卵周間隙稍變大。hCG后14.5 h，第一極體開始向圓球體變化，卵周間隙進一步變大。hCG后15.5 h，第一極體膨脹呈球體，邊界開始淡化，逐漸趨于瓦解退化。

圖3 不同時間的第一極體形態 ×200A:hCG后12.5 h的第一極體；B: hCG后13.5 h的第一極體；C: hCG后14.5 h的第一極體；D: hCG后15.5 h的第一極體

圖4 不同時間的第一極體染色體與胞質中紡錘體分離情況 ×200A:hCG后12.5 h的MII卵子；B:hCG后13.5 h的MII卵子；C:hCG后14.5 h的MII卵子；D. hCG后15.5 h的MII卵子

3 討論

雖然科學家在前期研究中已經證實，第一極體的基因組具有支持重構卵子正常受精、發育并獲得子代的生殖能力。對極體功能的認識獲得了突破性的進展。但是，因為小鼠第一極體排出后存活時間很短，在進行第一極體基因組移植的研究中，第一極體的選擇和分離時間窗是實驗的關鍵因素。是否所有時間段的第一極體都可以作為移植核供體，何時最適宜進行第一極體基因組移植，前期報道尚未對此進行深入探究。由于第一極體排出后，留在卵母細胞胞質中染色體一直處于第二次減數分裂中期階段，而第一極體會逐漸走向退化消散[10]。設想最早剛剛從初級卵母細胞中排出的最新鮮的第一極體可以更好地保持與卵母細胞胞質環境的同步性，其染色體活性更利于重構卵子的存活和后續發育。因此，本實驗根據極體從剛剛排出即hCG后12.5 h到趨于退化消散即hCG后15.5 h的生理狀態和時間跨度，設立了4個時間點進行探究。

根據實驗結果可見，從hCG后12.5 h到15.5 h，4個時間點的小鼠第一極體作為核供體，都可以成功構建重構卵子，正常受精，卵裂發育至囊胚。說明這4個時間點的第一極體染色體在被移入去核的卵母細胞胞質中后，均可以快速經歷凝集重構和調控細胞周期的重新編程，支持卵母細胞的后續發育。但實驗過程中顯示，12.5 h大部分第一極體剛剛排出，呈扁橢圓形，與胞質沒有完全分離。由于胞質骨架蛋白的牽拉作用，在取第一極體的操作過程中，經常會將胞質中的染色體和部分胞質連帶同時取出，無法徹底分離。造成12.5 h組第一極體的獲取效率較低。雖然12.5 h組存活的重構卵子在后續的體外受精率、卵裂率和囊胚形成率上與對照組沒有顯著差異。可以認為，對于剛剛排出的最新鮮的第一極體，其染色體發育階段可以很好的與卵母細胞胞質保持同步性。但是此時間點第一極體染色體分離率低，導致操作成功率低下，因此該時間點不是第一極體基因組移植的最佳選擇。

15.5 h組第一極體已經趨于退化，極體包膜逐漸變淡，極體胞質變粗糙。此時的第一極體基因組雖然可以支持重構卵母細胞受精和發育，但受精率顯著低于其他組。囊胚生成率也顯著低于對照組。不適宜選作第一極體基因組移植的時間窗。

相比之下，13.5 h和14. 5 h組的第一極體作為核供體，構建重構卵子的存活率、體外受精率、卵裂率和囊胚形成率與對照組相比沒有顯著差異。說明在這兩個時間窗內，第一極體染色體的發育狀態與卵母細胞胞質依舊保持較好的同步性。重構卵母細胞可以順利重新編程，進而進行受精，第二次減數分裂和卵裂等發育過程。因此，可以認為hCG后13.5～14.5 h是小鼠第一極體基因組移植的最佳時間窗。

在培養過程中，還發現各組PB1T重構胚的2細胞、4細胞以及囊胚生成時間均遲于對照組。受精后早期胚胎發育主要依賴于母性遺傳的胞質RNA和蛋白質調控[11]。因此重構胚的發育出現遲緩現象，可能是由于第一極體被注入胞質供體卵子時，會帶入少量同源胞質，染色體對異源胞質環境需要適應過程，對同源與異源胞質的調控先后次序和協調性存在調整過程。胞質狀態也是重構胚發育遲緩的另一關鍵因素。胞質供體在去核時需要經歷CB的處理，CB會增加胞質柔韌性，降低去核操作時卵子的死亡率，但也會抑制胞質中微絲微管的形成，影響重組卵母細胞的正常受精和發育[12]。因此，去核完成后，應注意延長洗滌次數和時間以徹底洗滌CB。即使殘留少量的CB 也可能對重構卵子的正常受精、卵裂產生很大的影響。除此之外，顯微操作對卵子的損傷，操作過程中的溫度變化，培養試劑成分的優化，胞質供體卵子去核時帶出的胞質量等均對移植成功率和后續發育率存在影響[13-15]。