超高脫乙酰度殼聚糖制備與表征綜合實驗設計

陳 偉, 柏正武

(武漢工程大學 環境與化工清潔生產實驗教學中心, 湖北 武漢 430073)

實驗教學是培養學生實踐能力、創新思維的重要環節。綜合性實驗教學改革與創新是實驗教學研究的熱點,也是構建和完善多層次實驗教學體系有效途徑[1]。將科研成果轉化為綜合實驗教學內容,能激發大學生科研興趣,提升科學研究和科技創新能力,促進教學科研融合,更有利于形成科研支持教學、教學科研協同發展的良好局面[2]。

甲殼素是自然界中含量豐富的氨基多糖,殼聚糖是甲殼素脫乙酰基的產物。殼聚糖因具有無毒、生物可降解和生物相容性等特點,被廣泛應用于水處理、藥物載體、化妝品、食品以及制藥等領域[3]。殼聚糖脫乙酰度(degree of deacetylation, D.D.)的高低和分子量的大小直接影響到殼聚糖及其衍生物的吸附特性[4-5]、抑菌性能[6]以及分離性能[7-8]。因此,不同分子量的超高脫乙酰度殼聚糖的制備具有重要的應用價值。

本課題組近年結合文獻報道,通過多次實驗,總結出一套成熟的制備超高脫乙酰度殼聚糖的方法,并合成了100多種手性識別能力強、穩定好的殼聚糖衍生物手性固定相[9]。本文基于課題組有關殼聚糖的研究成果,設計了超高脫乙酰度殼聚糖的制備與表征綜合實驗。本實驗從天然甲殼素的預處理出發,包含殼聚糖降解與脫乙酰反應、核磁共振分析、紅外光譜分析、高分子分子量的測定等內容,將殼聚糖制備、結構分析、分子量的測定和大型儀器的應用結合在一起。

1 實驗原理

甲殼素通過降解得到超高脫乙酰度殼聚糖(脫乙酰度大于95%),其降解的方法主要有化學降解、物理降解和酶降解等,化學降解又包括H2O2氧化法、酸性或堿性水解法等[10]。將甲殼素在含NaBH4的NaOH/H2O體系中回流反應,干燥后再在正戊醇/NaOH體系中回流反應,就能制備出超高脫乙酰度的殼聚糖(見圖1)。通過調整反應時間和溫度可以得到不同分子量殼聚糖。如果部分殼聚糖因氧化而呈黃色,可用NaBH4還原,使之變成白色。用該方法制備的殼聚糖脫乙酰度可以達到98%以上,該方法實用、可靠,簡單易行。

圖1 殼聚糖的制備途徑

2 實驗

2.1 試劑與儀器

試劑：蝦殼(工業級),購自濰坊市海納甲殼素廠；氫氧化鈉、硼氫化鈉、戊醇、冰醋酸、氯化鈉和溴化鉀均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司；氘代三氟乙酸,美國劍橋CIL(同位素標準品)公司。

儀器：烏氏黏度計(毛細管直徑0.5～0.6 mm)；低溫恒溫反應浴,鞏義市英峪予華儀器廠；JYL-C012九陽料理機,九陽股份有限公司；金屬絲編織網試驗篩(φ200 mm×50 mm, 0.15 mm/0.1 mm),中國航空工業第五四零廠；FT-IR紅外光譜儀,美國PerkinElmer公司；Agilent DD2 400 MHz核磁共振儀,美國安捷倫公司；Vario EL Ⅲ CHNOS型元素分析儀,德國Elementar公司。

2.2 實驗流程

實驗流程見圖2。

圖2 超高脫乙酰度殼聚糖的制備與表征流程

2.3 殼聚糖的制備

用蒸餾水將片狀蝦殼洗凈并干燥,粉碎、過篩,收集篩網下的蝦殼粉甲殼素作為原料。參考文獻[11]方法,稱取20.00 g干燥的甲殼素于500 mL的三口瓶中,按照甲殼素、NaBH4、NaOH、水質量比為10∶1∶81.82∶100分別加入163.64 g NaOH、2.00 g NaBH4、200.00 g蒸餾水中,升溫至140 ℃,回流反應4 h；將反應液倒入裝有蒸餾水的燒杯中攪拌后趁熱過濾,洗至中性,干燥；產品再按相同的比例重復反應4 h,得到超高脫乙酰的殼聚糖；然后,將以上制備的殼聚糖按照殼聚糖、NaBH4、NaOH、正戊醇質量比為10∶1.1∶50∶110加入到500 mL的三口瓶中，在150 ℃回流6 h,將反應液倒入裝有蒸餾水的燒杯中攪拌后趁熱過濾,用水洗至中性,烘干得13.8 g 白色有珍珠光澤的片狀固體,產率為69%。

2.4 殼聚糖脫乙酰度的測定

將15 mg殼聚糖完全溶解0.5 mL CF3COOD中,經核磁共振儀掃描得到譜圖。根據譜圖中不同化學環境的氫質子的積分面積,計算殼聚糖的脫乙酰度DD[12]。計算公式如下：

(1)

其中HAC表示甲殼素乙酰基上的甲基氫的峰面積,H1-6表示殼聚糖結構單元骨架上氫的峰面積。

2.5 殼聚糖黏均分子量的測定

將0.25 g殼聚糖溶解于0.1 mol/L CH3COOH與0.2 mol/L NaCl溶劑中,并用100 mL容量瓶定容,得到質量濃度為2.5 g/L的殼聚糖溶液；再用稀釋法分別配制質量濃度為0.25、0.5、1.0、1.5 g/L的殼聚糖溶液。經砂芯漏斗過濾,用移液管移取10 mL濾液于烏式黏度計中,在25 ℃的水浴中恒溫10 min以上[13]；用秒表分別測定5種殼聚糖溶液和溶劑在黏度計中的下落時間。根據Mark-Houwink方程計算殼聚糖的黏均分子量。

相對黏度ηr=t/t0(溶液流出時間/純溶劑的流出時間),增比黏度ηsp=ηr-1。在無限稀釋條件下,比濃黏度ηsp/c與lnηr/c的極限值都等于特性黏度[η],其中[η]=KMα,K=1.81×10-3,α=0.93[14]。

2.6 殼聚糖的紅外光譜和元素分析

采用KBr壓片法將樣品制成薄片,用紅外光譜儀掃描降解前后的殼聚糖,分辨率設為4 cm-1,掃描次數為16,分析降解殼聚糖的結構變化。甲殼素和殼聚糖中C、H和N用Elementar元素分析儀在CHN模式下測定。

3 結果與討論

3.1 殼聚糖脫乙酰度的測定

殼聚糖的脫乙酰度是指脫除乙酰基的糖殘基數占殼聚糖分子中的糖殘基數的百分數。殼聚糖脫乙酰度的測定方法主要有滴定法、核磁共振波譜法和色譜法等方法[15]。其中滴定法因裝置簡單、操作簡便,常用于脫乙酰度的測定[16],但滴定法存在著樣品用量較大、滴定操作不易控制、終點不易觀察等缺點。核磁共振波譜法(NMR)準確度高且重現性好,是美國材料與試驗協會認定的測定殼聚糖脫乙酰度標準方法[17],也是測定殼聚糖脫乙酰度最準確的方法之一。殼聚糖乙酰基上的甲基氫和結構單元骨架上氫的化學位移值不同,通過測試這兩部分氫質子的積分面積就可以計算出殼聚糖的脫乙酰度。

圖3為所制備的殼聚糖的1H NMR譜圖(圖上方數字為積分面積),δ=2.3×10-6處為殼聚糖中殘留的乙酰基上的甲基氫,δ=(3.73～5.43)×10-6處為殼聚糖結構單元骨架上的氫,將其積分面積分別代入公式(1),計算出殼聚糖脫乙酰度為99.3%。

圖3 殼聚糖的1H NMR譜圖(TFA-D, 298 K, 400 MHz)

3.2 殼聚糖黏均分子量的測定

分子量的高低對殼聚糖性質和應用有較大影響[6],用光散射法和凝膠色譜法分別可以測定殼聚糖的重均分子量和數均分子量。因本實驗只需得到相對的分子量，且這兩種方法的實驗設備較昂貴,故選擇黏度法測定分子量。殼聚糖的特性黏度直接反映了殼聚糖的分子量大小,黏度就越大,其相對分子量越高。

根據殼聚糖溶液流出時間和純溶劑的流出時間,計算相對黏度ηr和增比黏度ηsp,以比濃黏度ηsp/c對濃度c作圖,得一條曲線,以lnηr/c對c作圖得另一條曲線。將兩條曲線擬合后外推至濃度c→0,得到特性黏度[η],如圖4所示。由公式[η]=KMα(其中K=1.81×10-3,α=0.93)計算得殼聚糖黏均分子量為14.6萬。

圖4 特性黏度曲線

3.3 殼聚糖的紅外表征和元素分析

圖5為甲殼素與不同脫乙酰度的殼聚糖的傅里葉紅外(FTIR)譜圖。從圖5中a可以看出,在1 655 cm-1以及1 622 cm-1處有非常明顯吸收峰，為甲殼素的酰胺I帶特征吸收峰,該雙重峰分別是CO與相鄰的分子鏈上N—H或O—H之間形成兩種不同氫鍵形成的[18]；在1 560 cm-1左右吸收峰為酰胺Ⅱ帶特征吸收峰,N—H彎曲變形吸收峰；在1 315 cm-1左右吸收峰為酰胺III帶特征吸收峰,—C—N伸縮振動吸收峰。隨著脫乙酰度的增加,酰胺I和III帶的吸收峰逐漸消失,酰胺II帶的吸收峰隨著DD的提高從1 560 cm-1移向高波數至1 597 cm-1 [19]。當脫乙酰度為97.93%時的殼聚糖在1 654 cm-1處的峰強度明顯減弱,1 595 cm-1處的N—H變得更加尖銳：當DD為99.88%的殼聚糖的羰基吸收峰已經消失,只有1 597 cm-1處的N—H峰,視為完全脫乙酰。

圖5 甲殼素及殼聚糖的紅外光譜圖

FT-IR譜圖既能反映高分子官能團結構特征,又能反映高分子的結晶性。殼聚糖結晶度的增加會使C—H伸縮振動峰向低頻移動[18]。因此可以通過2 960～2 840 cm-1處的C—H伸縮振動吸收帶的變化來判斷殼聚糖結晶狀態的變化。從圖5可知,甲殼素的C—H伸縮振動峰為2 891 cm-1,而脫乙酰度97.93%和99.88%殼聚糖的C—H伸縮振動峰分別為2 884 cm-1和2 883 cm-1,C—H伸縮振動峰向低波數移動,表明制備的殼聚糖的結晶度有所升高。結晶度的提高雖然不利于殼聚糖進一步修飾反應,但高分子結構更加規整,有利于殼聚糖衍生物的分離性能和溶劑耐受性[9]。另外,甲殼素的1 075 cm-1處的振動吸收峰隨著脫乙酰度增加,逐漸變寬,表明殼聚糖分子的β-糖苷鍵發生了部分斷裂,殼聚糖分子量降低。

(C6H11NO4·0.25H2O)n元素分析結果:理論值,C含量為43.50%、H含量為7.00%、 N含量為8.46%; 實測值C含量為43.21, H含量為7.09, N含量為7.87,實測值和理論計算值誤差較小。依據C、H、N等元素的組成來推斷結構式,對樣品的純度要求很高,而殼聚糖在干燥時難以完全除去結晶水,在稱量過程中也容易吸附水,因此在計算結果時,采用了校正的方法,將理論值增加了0.25%的H2O。

4 結語

本文所介紹的殼聚糖的制備與表征是將科研成果中較為成熟且難度適中的內容轉化成學生可以實際操作的本科綜合性實驗,該實驗包含天然蝦殼的處理、粉碎、過篩、降解、脫乙酰等制備過程及紅外光譜、核磁共振光譜、元素分析和分子量的測定等表征過程。本綜合實驗的實驗條件簡單、結果可靠,實驗內容涉及有機化學、分析化學和高分子化學等學科的知識點,將科研與教學有機結合,強化了基礎,拓寬了學生的知識面。

在組織本科生課外科研活動的過程中,圍繞超高脫乙酰度的殼聚糖制備和表征,開展了一系列殼聚糖應用研究。申報并完成了與之相關的3項武漢工程大學生校長基金項目,完成了兩屆本科畢業論文。近3年,在該綜合實驗的實施和支撐下,應用化學專業的兩位學生獲得湖北省優秀學士學位論文,3位學生分別獲湖北省第8～10屆大學生化學(化工)學術創新成果報告會二等獎。