析因設(shè)計(jì)解析祛斑中藥復(fù)方體外干預(yù)黑色素生成的主效應(yīng)中藥

陳志春 ，張理平 ，王英豪 ，楊 策 ，蘭明金

（1.福州屏山制藥廠，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

色素增多性皮膚病是臨床上一類常見(jiàn)的皮膚病，有文獻(xiàn)［1］報(bào)道，僅黃褐斑在妊娠婦女中的發(fā)病率就高達(dá)53%，因此如何找尋有效抑制黑色素合成的天然藥物是目前研究的科學(xué)熱點(diǎn)之一。中藥復(fù)方活性成分復(fù)雜，藥理作用往往呈現(xiàn)出多環(huán)節(jié)、多途徑的特點(diǎn)，課題組認(rèn)為這也正是其針對(duì)色素增多性皮膚病的復(fù)雜病理，具有較好綜合療效優(yōu)勢(shì)的重要原因，在前期的實(shí)驗(yàn)研究中亦證實(shí)了祛斑中藥組方治療色素增多性皮膚病的療效確切，且呈現(xiàn)出多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)［2-5］。但如何剖析復(fù)方中不同作用環(huán)節(jié)或途徑的主效應(yīng)中藥或物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示藥效與其物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)性，亟待解決。因此本研究在前期實(shí)驗(yàn)［6］的基礎(chǔ)上，從自由基清除作用、SOD樣活性、抗紫外線催化作用和促黑色素分解作用等不同作用途徑為切入點(diǎn)，深入剖析組方中干預(yù)黑色素合成不同作用環(huán)節(jié)的主效應(yīng)中藥，為研究治療色素增多性皮膚病藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV236B中波紫外線照射儀（德國(guó)Waldman公司）；FA20004N型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-9100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；Anke TDL80-2B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH.S型數(shù)顯水浴鍋（上海錦屏儀表有限公司）；KQ-500E型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；PIPETTOR微量移液器（WKY型 100～500 μL，上海求精生化試劑儀器有限公司）。

1.2 試藥 山楂、山茱萸、當(dāng)歸等藥材均購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂，經(jīng)鑒定：山楂為薔薇科植物山里紅 Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.的干燥成熟果實(shí)；山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉；當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。左旋多巴（L-Dopa，西安潤(rùn)澤生物技術(shù)有限公司）；1，1-二苯基苦肼基（DPPH，美國(guó) Sigma 公司）；黃嘌呤氧化酶（美國(guó)Sigma公司）；鹽酸羥胺、次黃嘌呤、萘乙二胺鹽酸鹽、無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸、醋酸、乙醇等試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參照前期實(shí)驗(yàn)［6］，本研究選用3×2析因設(shè)計(jì)表，以山楂、當(dāng)歸、山茱萸為考察因素，每個(gè)因素設(shè)2個(gè)水平，進(jìn)行組方設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），得到表2的析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，其中一行為一種組方，按表中行數(shù)值取相應(yīng)克數(shù)的藥混合即得此組方，共8組。

表1 因素水平表g

2.2 組方的制備 將組方（山楂、當(dāng)歸、山茱萸等藥）的飲片分別粉碎成粗粉（40目）后，按表1量分別稱取適量粉末于具塞三角瓶中，并加入適量乙醇（見(jiàn)表 2），混勻，浸泡 0.5 h，超聲提取 1 h，提取 2次。分別過(guò)濾，減壓回收乙醇，制得濃度為250 g／L的藥液，備用。

2.3 自由基清除作用的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［7］的方法，取1 mL受試物（1～8號(hào)）的制備液，分別加到1 mL DPPH （0.1 mM）溶液中，在 37℃溫育 30 min，用分光光度計(jì)在516 nm處測(cè)定OD值。以乙醇代替受試物作為空白對(duì)照。自由基清除率的計(jì)算公式：

表2 析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案

式中：Ai為1 mL DPPH溶液＋1 mL受試物；Aj為1 mL乙醇＋1 mL受試物；Ao為1 mL DPPH溶液＋1 mL乙醇（空白對(duì)照）。

2.4 SOD樣活性的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［8］的方法，先將0.2 mL反應(yīng)物A溶液（0.5 mM次黃嘌呤，10 mM鹽酸羥胺）和0.8 mL受試物（1～8號(hào)）溶液［用EDTA-PBS（pH8.2）溶解受試物］，在37℃下培養(yǎng)10 min，接著將0.2 mL黃嘌呤氧化酶溶液（5 mU／mL）加入到上述溶液中，并將該混合物培養(yǎng)30 min；然后將2 mL反應(yīng)物B（終濃度為 20 μMN-1-萘乙二胺鹽酸鹽，2 mM對(duì)氨基苯磺酸，16.7%醋酸）加入到上述混合物中，在室溫下維持 30 min，用分光光度計(jì)在550 nm處測(cè)定OD值。SOD樣活性用抑制次黃嘌呤氧化酶催化所產(chǎn)生的超氧陰離子的百分比表示。以PBS代替受試物作為空白對(duì)照。

2.5 抗紫外線催化作用的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［9］的方法，先將3 mL多巴溶液（0.03%）和3 mL PBS溶解的受試物（1～8號(hào)）混合，在25℃下用紫外線照射儀照射10 h，然后用分光光度計(jì)在475 nm處測(cè)定OD值。以PBS代替受試物作為空白對(duì)照。

2.6 促黑色素分解作用的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［9］的方法，將3 mL多巴溶液（0.03%）用紫外線照射儀照射18 h，生成黑色素后，加入3 mL用PBS稀釋過(guò)的受試物（1～8號(hào)），搖勻，25℃下放置 12 h，然后用分光光度計(jì)在475 nm處測(cè)定OD值。以PBS代替受試物作為空白對(duì)照。

2.7 解析組方中主效應(yīng)中藥 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。析因分析采用F檢驗(yàn)，結(jié)果以（x±s）表示，分別解析祛斑中藥的自由基清除作用、SOD樣活性、抗紫外線的催化作用、促黑色素分解作用的主效應(yīng)、交互效應(yīng)、單獨(dú)效應(yīng)。

3 結(jié) 果

3.1 對(duì)自由基清除作用的影響 組方對(duì)自由基清除的作用試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)析因分析，A、B、C因素兩兩交互效應(yīng)見(jiàn)圖1。圖1中BC因素兩條直線相互不平行，說(shuō)明兩因素存在交互作用，即組方對(duì)自由基清除作用存在交互效應(yīng)，故需考慮交互作用。由 F 檢驗(yàn)結(jié)果（表 4）可知：FC因素＞FA因素＞FB因素*C因素＞FB因素，其中 C 因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；A、B、B*C 因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 因 C 因素與B因素存在交互作用，但B*C因素P＞0.05，故只需分析主效應(yīng)中藥。C因素（山茱萸）的貢獻(xiàn)度遠(yuǎn)比A因素（山楂）、B因素（當(dāng)歸）大，處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，尤其是山茱萸水平1對(duì)自由基清除作用最強(qiáng)（見(jiàn)圖1），是復(fù)方中自由基清除作用的主效應(yīng)中藥。

表3 各組方干預(yù)黑色素合成結(jié)果%

表3 各組方干預(yù)黑色素合成結(jié)果%

組方試驗(yàn)號(hào)12345678自由基清除活性抑制率60.5±3.2 17.5±1.9 50.9±3.4 31.0±5.5 47.6±4.5 22.9±3.9 52.8±5.3 13.7±2.9 SOD樣活性抑制率43.2±5.1 51.2±6.4 39.7±4.3 36.8±4.0 45.9±3.9 47.9±5.5 65.5±7.1 37.9±5.6抗紫外線催化作用抑制率40.0±4.3 37.4±3.5 43.1±5.1 47.8±3.9 46.4±4.4 57.4±6.2 53.6±4.8 51.0±6.0促黑色素分解作用抑制率24.4±3.1 21.9±3.0 27.6±2.5 22.1±5.0 18.2±3.9 17.8±1.9 16.0±1.4 29.7±2.2

表4 自由基清除作用析因方差分析表

3.2 對(duì)SOD樣活性的影響 組方對(duì)SOD樣活性的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。F檢驗(yàn)結(jié)果（表5）可知：A因素對(duì)SOD樣活性影響最大，但A、B、C三因素均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。組方對(duì)SOD樣活性的抑制作用是此復(fù)方的整體效應(yīng)。

3.3 對(duì)抗紫外線催化作用的影響 組方對(duì)抗紫外線催化作用的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)析因分析，A、B、C因素兩兩交互效應(yīng)見(jiàn)圖2。圖2中兩條直線均相互平行，說(shuō)明因素間不存在交互作用，即組方對(duì)抗紫

圖1 自由基清除作用的交互作用圖

表5 SOD樣活性析因方差分析表

外線催化作用不存在交互效應(yīng)，故只需考慮各因素的主效應(yīng)作用。由F檢驗(yàn)結(jié)果（表6）可知：FA因素＞＞FB因素＞Fc因素，其中 A 因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；B、C 因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。可見(jiàn) A 因素（山楂）的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)比B因素（當(dāng)歸）、C因素（山茱萸）大，處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，尤其山楂水平2對(duì)抗紫外線催化作用具顯著抑制作用（p＜0.05），見(jiàn)圖2，是復(fù)方中抗紫外線催化作用的主效應(yīng)中藥。

表6 抗紫外線催化作用析因方差分析表

圖2 抗紫外線催化作用的交互作用圖

3.4 對(duì)促黑色素分解作用的的影響 組方對(duì)促黑色素分解作用的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。F檢驗(yàn)結(jié)果（表7）可知：A因素對(duì)促黑色素分解作用的影響最大，但A、B、C三因素均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。組方對(duì)促黑色素分解作用的抑制作用是此復(fù)方的整體效應(yīng)。

表7 促黑色素分解作用析因方差分析表

4 討論

色素增多性皮膚病是皮膚科、美容科常見(jiàn)的疑難病癥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療多采用維甲酸、壬二酸、曲酸、止血環(huán)酸、果酸、抗壞血酸等藥物，祖國(guó)醫(yī)學(xué)治療則常用山茱萸、黃芩、紅花、大黃等中藥，但迄今為止中西醫(yī)都尚無(wú)療效確切的治療良藥［10-11］。祛斑中藥復(fù)方是課題組治療色素增多性皮膚病的常用驗(yàn)方，前期實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)酪氨酸酶的活性有很強(qiáng)的抑制作用［2-5］，故推測(cè)祛斑中藥復(fù)方的多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，是其綜合治療色素增多性皮膚病的特色和優(yōu)勢(shì)。盡管該復(fù)方是基于臨床實(shí)踐以及相關(guān)組方配伍理論而建立的，但其多途徑、多靶點(diǎn)藥理效應(yīng)終究是其復(fù)雜的、特定的物質(zhì)基礎(chǔ)反應(yīng)。因而，我們進(jìn)一步剖析了祛斑中藥復(fù)方不同作用途徑的主要中藥，發(fā)現(xiàn)山茱萸是方中酪氨酸酶活性抑制、多巴自動(dòng)氧化抑制的主效應(yīng)中藥［6］。

然黑色素合成是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，該過(guò)程除與酪氨酸酶、多巴色素自動(dòng)氧化等因素密切相關(guān)外，還與自由基、黑色素降解及紫外線等因素密切相關(guān)。因而本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行了DPPH自由基清除作用及SOD樣活性的研究。DPPH自由基清除試驗(yàn)和SOD樣活性試驗(yàn)均是針對(duì)自由基的，前者消除的是中等穩(wěn)定的DPPH自由基，后者消除的則是極不穩(wěn)定的超氧陰離子。本研究結(jié)果表明：組方對(duì)自由基均呈現(xiàn)出一定的抑制作用；對(duì)超氧陰離子的抑制是組方的整體效應(yīng)；而對(duì)DPPH自由基，各藥抑制率依次為 FC因素＞FA因素＞FB因素*C因素＞FB因素， 山茱萸的貢獻(xiàn)度遠(yuǎn)比山楂、當(dāng)歸大，處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，山茱萸對(duì)DPPH自由基抑制明顯（p＜0.05），是方中自由基清除作用的主效應(yīng)中藥。本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了促黑色素分解作用及抗紫外線催化作用的研究，結(jié)果表明：促黑色素分解作用是組方的整體效應(yīng)；各藥對(duì)抗紫外線催化作用的抑制率依次為FA因素＞＞FB因素＞Fc因素，山楂的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)比當(dāng)歸、山茱萸大，處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，山楂對(duì)抗紫外線催化作用抑制明顯（p＜0.05），是方中抗紫外線催化作用的主效應(yīng)中藥。

正是由于中藥復(fù)方具有多途徑、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的藥理效應(yīng)，必然存在不同作用途徑的主要中藥或主要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確了祛斑中藥復(fù)方在治療色素增多性皮膚病不同黑色素合成途徑方面的主效應(yīng)中藥或組合，研究結(jié)果從某種程度上印證了這一理論。這種研究模式，既對(duì)中藥復(fù)方配伍的現(xiàn)代詮釋具有重要意義，又可為高效、廉價(jià)、安全的祛斑中藥研發(fā)提供思路。