乳酸細菌內毒素檢查方法研究

馬云艷

【摘 要】根據《中國藥典》2015年版四部通則1143細菌內毒素檢查法要求，建立乳酸細菌內毒素檢查方法。通過預干擾試驗，確定乳酸最終濃度為0.4mg/ml以下，選取濃度為0.2mg/ml，對鱟試劑與細菌內毒素之間的聚集反應無干擾作用。故該方法可作為乳酸的細菌內毒素檢查方法使用。

【關鍵詞】乳酸；細菌內毒素檢查

乳酸純品為無色液體，無氣味，具有吸濕性，能與水、乙醇、甘油混溶。在食品、醫藥、工業、化妝品、農產品及農業等領域廣泛應用。本文中乳酸作為地佐辛注射液及雷莫司瓊注射液的藥用輔料使用，選用湛江安度斯生物有限公司生產的鱟試劑進行預干擾試驗，然后用兩個鱟試劑生產廠家即湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司，分別進行干擾試驗。通過本試驗研究了解乳酸對細菌內毒素試驗的適用性，為制劑質量標準制定細菌內毒素檢查項提供試驗依據。

一、儀器及試驗試劑

（一）儀器

內毒素凝膠法測定議

漩渦混合器

移液器

（二）試劑、無熱原吸頭

細菌內毒素工作標準品 10EU/ml 批號：1704260 購自湛江安度斯生物有限公司

細菌內毒素檢查用水 內毒素含量<0.003EU/ml 批號：1703030購自湛江安度斯生物有限公司

鱟試劑 0.25EU/ml 批號：1704102購自湛江安度斯生物有限公司

鱟試劑 0.25EU/ml 批號：1608110購自湛江博康海洋生物有限公司

鱟試劑 0.125Eu/ml 批號：1609200購自湛江安度斯生物有限公司

鱟試劑 0.06Eu/ml 批號：1608012購自湛江安度斯生物有限公司

稀釋劑Ⅱ 批號：1701120購自湛江安度斯生物有限公司

無熱原吸頭（250ul） 批號： 1702280購自湛江安度斯生物有限公司

無熱原吸頭（1000ul） 批號： 1612130購自湛江安度斯生物有限公司

（三）樣品信息

乳酸 批號171001 無錫某制藥有限公司

二、細菌內毒素檢查方法

（一）細菌內毒素限值的確定

依據地佐辛注射液說明書的用法用量計算乳酸限值（10EU/mg），雷莫司瓊注射液說明書的用法用量計算乳酸限值（75EU/mg）綜合考慮，以最小值取四倍安全系數，確定乳酸細菌內毒素限值為2.5EU/mg。

（二）鱟試劑靈敏度符合

按照《中國藥典》2015年版四部通則1143細菌內毒素檢查法規定，進行鱟試劑靈敏度符合，結果均符合規定。

（三）預試驗

1.試驗過程

現有的鱟試劑濃度為0.25Eu/ml、0.125Eu/ml、0.06Eu/ml。乳酸有效稀釋濃度（MVC）范圍按公式MVC=λ/L，L=2.5Eu/mg。計算可知，乳酸最低有效濃度為0.024～0.1mg/ml。選取0.25Eu/ml的鱟試劑進行預干擾試驗。

取1ml乳酸稱重約為1.2g，即為1200mg/ml的供試品原液，以稀釋劑Ⅱ對供試品原液進行稀釋，將此系列濃度記為S。同時在上述溶液中加入細菌內毒素標準溶液，使每一濃度的溶液中均含0.5Eu/ml濃度的細菌內毒素，將此系列溶液記為SE，取鱟試劑0.25EU/ml與上述相應S和SE反應，每一濃度重復做兩管，并設陽性和陰性對照。根據試驗結果，在S均為陰性，陽性、陰性對照為陽性和陰性的情況下，選取開始出現陽性的SE所對應濃度的下一級濃度為MVC。結果如下：

通過預干擾試驗，在濃度為0.4mg/ml下無干擾，選取下一濃度，即0.2mg/ml為不干擾濃度進行試驗。

（四）正式干擾實驗

為了最終確認是否存在干擾因素的影響，進行以下正式干擾試驗。取供試樣品用稀釋劑Ⅱ進行稀釋，使其最終無干擾試驗稀釋濃度為0.2mg/ml，按《中國藥典》2015年版四部通則1143中的“細菌內毒素檢查法干擾試驗項”進行試驗。

結果如下：

鱟試劑廠家：湛江博康海洋生物有限公司 λ=0.25EU/ml

鱟試劑廠家： 湛江安度斯生物有限公司 λ=0.25EU/ml

正式干擾試驗結果表明：0.2mg/ml稀釋液對Et均在0.5ES～2.0ES范圍內，確認無干擾影響。

（五）供試品細菌內毒素檢測

按《中國藥典》2015年版四部通則1143中“細菌內毒素檢查法”使用兩個廠家的鱟試劑分別對供試品進行細菌內毒素檢查，結果均符合規定。

三、討論

（一）通過預干擾試驗結果表明，湛江安度斯生物有限公司生產的鱟試劑與供試品在0.4mg/ml稀釋液以下濃度范圍內反應無干擾作用。

（二）正式干擾試驗選用0.2mg/ml供試品稀釋液，與兩個廠家的鱟試劑反應結果Et均在0.5ES～2ES范圍內，確認無干擾影響。內毒素限值若為2.5EU/mg，則稀釋液濃度在0.2mg/ml以下，一般不會產生干擾影響，可以完成正常檢測。

（三）細菌內毒素表述為：取本品，依法檢查（《中國藥典》2015年版四部通則1143），每1mg乳酸中含內毒素的量應小于2.5EU。