夫拉平度對(duì)人宮頸癌CasKi細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的抑制作用研究

周煥芹

[摘要] 目的 研究周期蛋白激酶（CDKs）抑制劑夫拉平度（Flavopiridol， FP）對(duì)人宮頸癌CasKi細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。方法 2017年7—8月在聊城市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室建立CasKi細(xì)胞裸鼠模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑組、FP組及FP和順鉑聯(lián)合用藥組，每組8只裸鼠，4組均于腫瘤抑制成功后瘤體直徑平均為0.8 cm開(kāi)始給藥，給藥3周，2次/周。最后一次給藥5 d后處死全部裸鼠，測(cè)量移植瘤的體積和重量，采用免疫印跡法檢測(cè)對(duì)各組中腫瘤組織凋亡蛋白Caspase 3表達(dá)的影響，并采用分光光度法測(cè)定裸鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平。結(jié)果 與對(duì)照組相比[（567.02±89.38）V/mm3；（0.63±0.07）m/g]，順鉑組[（114.50±18.07）V/mm3，（0.12±0.04）m/g]、FP組[（106.74±21.39）V/mm3；（0.10±0.02）m/g]及FP和順鉑聯(lián)合用藥組[（88.59±19.84）V/mm3，（0.07±0.02）m/g]荷瘤體積和重量明顯減小（P<0.05）；順鉑組、FP組及FP和順鉑聯(lián)合用藥組Caspase 3表達(dá)均顯著增加（P<0.05）；與對(duì)照組相比[（134.68±45.63）U/mL，（3.45±1.47）mmol/L]，順鉑組[（143.72±44.45）U/mL，（2.76±2.83）mmol/L]、FP組[（156.51±32.53）U/mL，（2.64±0.66）mmol/L]及FP和順鉑聯(lián)合用藥組[（208.37±63.35）U/mL，（2.38±1.13）mmol/L]血清SOD的活性顯著升高（P< 0.05），MDA的含量顯著降低（P< 0.05）。結(jié)論 夫拉平度對(duì)人宮頸癌CasKi細(xì)胞皮下種植瘤生長(zhǎng)具有抑制作用，且與促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 夫拉平度；順鉑；宮頸癌；生長(zhǎng)抑制；凋亡； 氧化應(yīng)激

[中圖分類(lèi)號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2018）04（c）-0018-04

Research on Inhibition Effect of Flavopiridol on the Growth of in Human Cervical Carcinoma CasKi Subcutaneous Implanted in Nude Mice

ZHOU Huan-qin

Department of Pharmacy， Liaocheng Peoples Hospital， Liaocheng， Shandong Province， 252000 China

[Abstract] Objective To study the effect of flavopiridol （FP） on human cervical carcinoma subcutaneous implanted tumor growth inhibition in mice bearing CasKi cell. Methods The nude rat model of cervical cancer cell was established from July to August 2017 in Central laboratory of Liaocheng Peoples Hospital. The nude rat were randomly divided into four groups （control group， cisplatin group， FP group and combined treatment group， 8 rats in each group）， and the four groups were administered when the average tumor diameter was 0.8 cm， 3 w， and 2 times/w， and all the mice were sacrificed in 5 days after the adminitration， and the volume and weight of tumors were tested. And the expression of caspase3 was determined by immunoblotting. And the SOD and MDA levels were measured by the spectrophotometry. Results The tumor volume and weight obviously decreased in the cisplatin group[（114.50±18.07）V/mm3；（0.12±0.04）m/g]， FP group[（106.74±21.39）V/mm3； （0.10±0.02）m/g] and combined treatment group[（88.59±19.84）V/mm3；（0.07±0.02）m/g]（P<0.05） compared with that in the control group[（567.02±89.38）V/mm3；（0.63±0.07）m/g）]， and the expression of caspase 3 in the cisplatin group， FP group and combined treatment group obviously increased compared with that in the control group [（134.68±45.63）U/mL，（3.45±1.47）mmol/L]. The activition of serum SOD in the cisplatin group[（143.72±44.45）U/mL，（2.76 ±2.83）mmol/L]， FP group[（156.51±32.53）U/mL，（2.64±0.66）mmol/L] and combined treatment group[（208.37±63.35）U/mL，（2.38±1.13）mmol/L] obviously increased （P<0.05）， the contents of MDA obviously decreased （P<0.05）. Conclusion FP has an inhibition effect on the growth of in human cervical carcinoma CasKi subcutaneous implanted in nude mice， which is related to promoting the apoptosis of cancer cells and inhibiting the oxidative stress reaction of the body.

[Key words] Flavopiridol； Cisplatin； Cervical carcinoma； Growth inhibition； Apoptosis； Oxidative stress

宮頸癌是危害女性健康常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率較高，在發(fā)展中國(guó)家婦女中其發(fā)病率居第一位，且近年來(lái)宮頸癌發(fā)病率上升趨勢(shì)明顯[1-2]。因此，尋找治療宮頸癌的有效方法是目前的研究熱點(diǎn)之一。早期宮頸癌治療后患者5年生存率較高，然而對(duì)于中晚期宮頸癌患者，易出現(xiàn)周?chē)M織腫瘤轉(zhuǎn)移，手術(shù)和放療均難取得滿意的治療效果。因此，化療在宮頸癌治療中日益受到重視，然而目前化療藥物均存在不良反應(yīng)大、久用易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，因此尋找選擇性高、不良反應(yīng)小而有效的宮頸癌治療藥物尤為重要。夫拉平度（Flavopiridol， FP）為周期蛋白激酶（CDKs）抑制劑，通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)紊亂的CDK激酶活性，可以抑制人白血病細(xì)胞、食道和胃癌及乳腺癌細(xì)胞的增殖[3-4]。另有研究[5-6]報(bào)道宮頸癌細(xì)胞內(nèi)CDKs表達(dá)較正常組織增加，然而夫拉平度對(duì)宮頸癌的治療作用機(jī)制尚未明確。因此，該研究在2017年7—8月間采用人宮頸癌CasKi細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑組、FP組及FP和順鉑聯(lián)合用藥組，每組8只裸鼠，通過(guò)給予FP觀察FP及FP和順鉑聯(lián)合用藥對(duì)宮頸癌裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)不同程度的抑制作用及對(duì)血清SOD的影響并探討其可能機(jī)制，以期為宮頸癌新的臨床治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

Balb/c雌性裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級(jí)飼養(yǎng)，4～6周齡，體重18～22 g， 該研究嚴(yán)格遵守聊城市人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理相關(guān)規(guī)定，并通過(guò)了倫理委員會(huì)審批；人宮頸癌CaSki細(xì)胞株購(gòu)自北京腫瘤研究所；順鉑（6 mL∶30 mg，批號(hào)：170603）；兔抗人Caspase-3多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling；FP購(gòu)自sigma（批號(hào)：S159342）；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均來(lái)自碧云天生物技術(shù)研究所；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞于含RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液pH 7.2～7.4，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液1次/2～3 d。

1.2.2 宮頸癌裸鼠荷瘤模型的建立 取指數(shù)生長(zhǎng)期得腫瘤細(xì)胞，胰酶消化后，以10%磷酸鹽緩沖溶液（PBS）制成濃度為1×107個(gè)/mL細(xì)胞的細(xì)胞懸液中，然后碘伏及75%酒精常規(guī)消毒裸鼠左腋下皮膚后，取0.2 mL的CaSki細(xì)胞懸液分別注射于裸鼠的左前肢腋下，注射結(jié)束后用鑷子夾緊針孔，防止細(xì)胞懸液滲漏。

1.2.3 分組及治療 接種結(jié)束后將32只棵鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑組、FP組及聯(lián)用組。自接種后28 d，待裸鼠荷瘤瘤體直徑均值（mean tumor diameter， MTD）達(dá)8 mm大小時(shí)開(kāi)始給藥治療，對(duì)照組以0.2 mL生理鹽水腹腔內(nèi)注射；順鉑組腹腔內(nèi)注射0.2 mL順鉑（批號(hào)：170603），劑量為2 mg/（kg·d）；FP組腹腔內(nèi)注射0.2 mL FP（批號(hào)：S159342），劑量為10 mg/kg；聯(lián)用組順鉑與FP聯(lián)合給藥[順鉑2 mg/（kg·d），F(xiàn)P 10 mg/kg]。4組均給藥3周，給藥2次/周。

1.2.4 腹水及盆腔內(nèi)轉(zhuǎn)移情況 最后一次給藥5 d后，脫臼處死全部裸鼠并打開(kāi)腹腔，仔細(xì)檢查有無(wú)腹水，依次探查腹腔和盆腔內(nèi)臟器，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移灶情況。

1.2.5 各組裸鼠皮下移植瘤重量及體積的測(cè)量 完整剝離各組腫瘤組織并準(zhǔn)確測(cè)量腫瘤重量；用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑，計(jì)算腫瘤體積。體積按照公式V=1/πab2計(jì)算（a為瘤塊最大徑，b為最小徑）。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)腫瘤組織Caspase-3表達(dá)水平 提取腫瘤組織總蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入上樣緩沖液。以100 μg上樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，后100 V恒壓轉(zhuǎn)膜。取轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素濾膜，封閉后加入兔抗人激活型Caspase-3（1∶1 000）抗體。膜置于一抗中，4℃ 冰箱過(guò)夜孵育。洗膜后以二抗孵育2 h。然后TBS洗膜5 min×3次，置BCIP/NBT顯色液顯色。掃描蛋白印跡顯影圖，利用凝膠自動(dòng)分析成像軟件Image J 軟件計(jì)算目的蛋白表達(dá)的灰度值。

1.2.7 活性測(cè)定 裸鼠處死取血，用于測(cè)定MDA 含量和SOD 的活性，按照試劑盒規(guī)定的方法比色測(cè)定吸光度，按公式換算成SOD 的活性以及MDA的濃度的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用one-way ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠致瘤率

各組裸鼠均于接種7 d后明顯成瘤，移植瘤模型成功建立，接種成功率為100%。

2.2 各組腹水及盆腔轉(zhuǎn)移情況

裸鼠最后一次給藥5 d后脫臼處死并解剖，各組裸鼠腹腔內(nèi)未見(jiàn)腹水，經(jīng)過(guò)腹腔和盆腔各臟器探查，均未見(jiàn)明顯轉(zhuǎn)移灶。

2.3 各組裸鼠皮下種植瘤重量及體積差異

與對(duì)照組相比，順鉑組、FP組和聯(lián)合用藥組荷瘤體積和重量均顯著降低（P<0.05）；此外，與順鉑組相比，聯(lián)合用藥組荷瘤體積及重量均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.4 各組裸鼠血清SOD活性和MDA的含量差異

與對(duì)照組相比，順鉑組、FP組和聯(lián)合用藥組血清SOD活性均顯著提高（P<0.05），MDA的含量顯著降低（P<0.05）；與順鉑組相比，聯(lián)合用藥組血清SOD活性均顯著提高（P<0.05），MDA的含量顯著降低（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.5 各組腫瘤組織中Caspase 3蛋白的表達(dá)差異

免疫印跡結(jié)果顯示，順鉑組、FP組和聯(lián)合用藥組腫瘤組織Caspase 3蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與順鉑組相比，聯(lián)合用藥組腫瘤組織Caspase 3蛋白表達(dá)較高。見(jiàn)圖1。

3 討論

細(xì)胞周期的正常運(yùn)行依賴(lài)于精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，CDK為細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，具有促進(jìn)細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)變、啟動(dòng)DNA合成、調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄等重要功能[7-8]。當(dāng)CDK失調(diào)控時(shí)，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)約90%的腫瘤存在CDK的活性增強(qiáng)[9-12]，因此，近幾年CDKs已成為腫瘤治療的重要研究靶點(diǎn)。同時(shí)研究顯示[4，9，12]，宮頸癌組織和癌旁組織內(nèi)CDKs過(guò)表達(dá)，且CDKs的表達(dá)與宮頸癌惡性程度、分化等密切相關(guān)。

FP為最初來(lái)源于一種印度植物的黃酮物質(zhì)，因具有CDKs抑制活性，其抗腫瘤活性近年逐漸受到關(guān)注。近年研究[13]發(fā)現(xiàn)FP對(duì)白血病細(xì)胞、食道和胃癌細(xì)胞的增殖具有較好的抑制作用，其中胃癌的腫瘤細(xì)胞抑制率可達(dá)85%，其抗腫瘤活性與阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生長(zhǎng)等機(jī)制有關(guān)。該文研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)P對(duì)人宮頸癌CasKi細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的體積和重量的增加具有顯著抑制作用；另外，該研究采用FP聯(lián)合一線化療藥物順鉑聯(lián)合用藥，發(fā)現(xiàn)二者具有協(xié)同抗腫瘤作用，其對(duì)腫瘤的體積和重量增高的抑制效應(yīng)顯著增強(qiáng)，腫瘤的體積的重量都顯著低于對(duì)照組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)較對(duì)照組，F(xiàn)P和FP順鉑聯(lián)合用藥可顯著降低裸鼠血清MDA的含量，提高SOD的活性。這說(shuō)明FP對(duì)宮頸癌移植瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，同時(shí)可顯著降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，且與順鉑聯(lián)用大大增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌的治療效果。

另外，抑制CDKs可限制腫瘤細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)及加速細(xì)胞凋亡，已有研究[14]發(fā)現(xiàn)FP可使乳腺癌細(xì)胞阻滯在G1和G2期，并引起細(xì)胞的凋亡，凋亡率可達(dá)90%，其機(jī)制可能與FP直接抑制CDK2和CDK3的活性有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)FP可上調(diào)裸鼠腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果與前期報(bào)道相一致[15]；此外，聯(lián)合用藥組腫瘤組織內(nèi)Caspase 3蛋白表達(dá)較順鉑單獨(dú)用藥組高，這提示，F(xiàn)P對(duì)人宮頸癌CasKi細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的抑制作用可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序化凋亡有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)P對(duì)人宮頸癌CasKi細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)抑制作用，其保護(hù)作用與促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞的凋亡及降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平有關(guān)；此外，F(xiàn)P與順鉑聯(lián)合用藥可以增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌生長(zhǎng)的抑制效果，該研究將為宮頸癌新化療藥物的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2018-01-22）