山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織病理變化的影響

孟敏　楊翠翠　張麗

摘要：目的 觀察山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)血管性癡呆（VD）大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織病理變化的影響，探討其相關(guān)機(jī)制。方法 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥組和山茱萸環(huán)烯醚萜苷低、中、高劑量組。采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（2VO）手術(shù)造模，術(shù)后6 h開始灌胃給藥，每日1次，共3個(gè)月。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠識(shí)別記憶能力。免疫組化染色檢測腦組織存活神經(jīng)元和膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶（ChAT）表達(dá)。結(jié)果 永久性2VO術(shù)后3個(gè)月，模型組大鼠逃避潛伏期延長，識(shí)別指數(shù)降低，海馬和大腦皮層NeuN陽性神經(jīng)元存活數(shù)減少，ChAT表達(dá)降低；與模型組比較，山茱萸環(huán)烯醚萜苷各劑量組大鼠逃避潛伏期縮短，識(shí)別指數(shù)升高，海馬和大腦皮層NeuN陽性神經(jīng)元存活數(shù)增多，海馬ChAT表達(dá)升高。結(jié)論 山茱萸環(huán)烯醚萜苷通過保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn)ChAT表達(dá)從而改善VD大鼠的認(rèn)知功能障礙。

關(guān)鍵詞：山茱萸環(huán)烯醚萜苷；雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎；血管性癡呆；認(rèn)知功能障礙；神經(jīng)元存活；膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）06-0056-05

Effects of Cornel Iridoid Glycoside on Learning-memory Ability and Brain Pathological Changes in Vascular Dementia Rats

MENG Min， YANG Cui-cui， ZHANG Li， LI Ya-li， ZHANG Lan， LI Lin

Department of Pharmacy， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing Engineering Research Center for Nervous System Drugs， Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education， Beijing 100053， China

Abstract： Objective To investigate the effects of cornel iridoid glycoside （CIG） on the learning-memory ability and pathological changes in the brain of vascular dementia （VD） rats； To discuss relevant mechanism of action. Methods SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， positive medicine group， CIG groups low-， medium- and high-dose groups. The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion （2VO） in rats. Drugs were intragastrically administered 6 h after surgery and then once a day for 3 months. Morris water maze test was used to detect spatial learning-memory ability， and recognition memory was measured by the object recognition test. Immunohistochemical staining was used to detect the neuronal survival and the expression of choline acetyltransferase （ChAT） in the brain. Results Three months after permanent 2VO operation， the model rats showed a longer escape latency in Morris water maze， a lower discrimination index in the object recognition test， and a decrease in NeuN positive neuronal survival and ChAT expression in the hippocampus and cerebral cortex. Compared with the model group， intragastric administration of CIG for 3 months shortened the escape latency in Morris water maze， elevated the discrimination index in the object recognition test， and increased the NeuN positive neuronal survival in the hippocampus and cerebral cortex and ChAT expression of 2VO rats. Conclusion CIG can improve the cognitive impairment of VD model rats through protecting neurons and promoting ChAT expression.

Keywords： corneliridoid glycoside； bilateral common carotid artery ligation； vascular dementia； cognitive impairment； neuronal survival； choline acetyltransferase； rats

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由缺血性卒中、出血性卒中及造成記憶、認(rèn)知和行為等腦區(qū)低灌注腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征。大鼠永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（bilateral common carotid artery ligation，2VO）致慢性腦血流灌注不足模型能很好地模擬人VD中認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)元死亡等病理變化。山茱萸環(huán)烯醚萜苷（cornel iridoid glycoside，CIG）是從傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥山萸肉中提取的有效組分。本課題組以往研究表明，CIG能改善局灶性腦缺血大鼠模型的神經(jīng)功能缺損，抑制腦組織炎癥和神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管新生[1-2]；并可改善穹窿-海馬傘切斷模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，增高腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子含量和神經(jīng)元存活[3]。本實(shí)驗(yàn)采用永久性2VO大鼠模型模擬VD，觀察CIG對(duì)該模型學(xué)習(xí)記憶功能和腦組織神經(jīng)元存活的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量260～280 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，12 h光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物

CIG，本研究室從山萸肉中提取，純度70%；尼莫地平，正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)20151126。

1.3 主要試劑與儀器

抗NeuN抗體，Abcam公司（ab177487）；抗膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（ChAT）抗體，博士德公司（BA0596）；生物素標(biāo)記的抗兔IgG，中杉金橋公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，Vector Laboratories公司；DAB顯色試劑盒，西雅金橋公司。Morris水迷宮，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；冰凍切片機(jī)，Thermo公司；生物顯微鏡，Olympus公司。

1.4 造模

待大鼠體質(zhì)量達(dá)到300 g，進(jìn)行永久性2VO手術(shù)。10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，行頸正中切口，游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎，涂抹青霉素粉末并縫合傷口。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎。

1.5 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（17只）、模型組（14只）、陽性藥組（16 mg/kg，14只）和CIG低劑量組（30 mg/kg，15只）、CIG中劑量組（60 mg/kg，16只）、CIG高劑量組（120 mg/kg，14只），各給藥組造模術(shù)后6 h開始給予相應(yīng)藥物灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。給藥體積1 mL/100 g，每日1次，共3個(gè)月。實(shí)驗(yàn)過程動(dòng)物死亡假手術(shù)組6只、模型組2只、CIG低劑量組2只、CIG中劑量組4只、CIG高劑量組1只和陽性藥組2只。除假手術(shù)組1只因牙齒過長戳破口腔死亡，1只為同籠互相打斗致死外，其余動(dòng)物均為麻醉死亡或手術(shù)后遺癥（腸梗阻、術(shù)后出血）死亡。

1.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮直徑200 cm，水深30 cm，水溫（20±3）℃，水面平均分成4個(gè)象限。根據(jù)Vorhees C V等[4]方法，每日每只大鼠訓(xùn)練2次，120 s/次，共5 d，平臺(tái)放置在任意象限，平臺(tái)位于水下1.5 cm，選取平臺(tái)鄰象限和對(duì)象限作為入水點(diǎn)，記錄大鼠在120 s內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。

1.7 物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

將大鼠曠場箱隔離成2個(gè)等大的箱子，長80 cm、寬40 cm、高40 cm，根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法，實(shí)驗(yàn)分3部分，適應(yīng)期：第1日，將大鼠放入箱中，箱中不放任何物體，10 min/只；熟悉期：第2日，在箱中放入2個(gè)相同物體（A，A），記錄大鼠對(duì)2個(gè)物體的關(guān)注時(shí)間（以鼠嘴的方向?qū)χ矬w，湊近約2 cm范圍內(nèi)計(jì)時(shí)，鼠趴在物體上或者只在物體附近走動(dòng)則不能計(jì)時(shí)[6]）；測試期：第3日，將其中一個(gè)物體換成新物體，記錄大鼠對(duì)新、舊物體的關(guān)注時(shí)間，計(jì)算識(shí)別指數(shù)。識(shí)別指數(shù)為大鼠關(guān)注新舊物體時(shí)間差與關(guān)注新舊物體時(shí)間和的比值。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用消毒液清潔盒子和物品，消除氣味。

1.8 取材

每組取4只大鼠，10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后開胸，剪開心包膜，暴露心臟和主動(dòng)脈弓。用鈍頭針頭插入左心室至主動(dòng)脈弓，灌注0.9%氯化鈉注射液200 mL，經(jīng)體循環(huán)和肺循環(huán)沖洗全身血管，待右心耳流出液無色透明時(shí)，灌注4%多聚甲醛200 mL，至大鼠全身僵硬。灌注后2 h，開顱取腦，固定，冰凍，取冠狀位，連續(xù)切片（厚40 μm）。

1.9 免疫組化檢測

每組取4只大鼠，每只取3張腦片，所選切片于3%H2O2室溫孵育30 min，PBST洗3次×5 min，加入10%羊血清，室溫孵育30 min，傾去。滴加抗NeuN抗體（1∶200）或抗ChAT抗體（1∶200），4 ℃過夜；PBST洗3次，每次5 min。加生物素標(biāo)記抗兔IgG工作液，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次×5 min。加適量過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次×5 min。DAB顯色，自來水終止顯色，晾干后，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

隨訓(xùn)練時(shí)間增加，逃避潛伏期呈逐漸縮短趨勢(shì)；第4、5日，模型組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長（P<0.05）；CIG各劑量組大鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表1。

2.1.2 物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在熟悉期所有大鼠對(duì)2物體均無偏好；在測試期模型組識(shí)別指數(shù)較假手術(shù)組明顯降低（P<0.01），CIG各劑量組大鼠識(shí)別指數(shù)較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

2.2 山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)模型大鼠腦組織神經(jīng)元存活的影響

模型組大鼠大腦皮層和海馬NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)較假手術(shù)組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CIG各劑量組大鼠大腦皮層和海馬NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表3、圖1和圖2。

2.3 山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)模型大鼠海馬膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

模型組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)較假手術(shù)組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CIG各劑量組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表4、圖3。

3 討論

大鼠永久性2VO可引起慢性腦血流灌注不足，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙，與VD臨床癥狀相似。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶功能的重要手段。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2VO術(shù)后3個(gè)月，模型組大鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙，給予CIG可明顯改善模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。我們還應(yīng)用物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的識(shí)別記憶功能，發(fā)現(xiàn)模型組識(shí)別指數(shù)較假手術(shù)組明顯降低，CIG各劑量組識(shí)別指數(shù)顯著升高。表明CIG能明顯改善2VO模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，提示其可能有助于改善VD臨床癥狀。

在2VO造成的VD模型中，由于缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷及死亡，這是VD主要病理改變[7-9]。本課題組以往應(yīng)用尼氏染色方法檢測的結(jié)果表明，大鼠2VO術(shù)后30 d，海馬錐體細(xì)胞密度輕度減低；術(shù)后60 d，細(xì)胞核固縮深染，細(xì)胞密度顯著減低，表明有大量的海馬錐體細(xì)胞死亡[10]。近年來多用神經(jīng)核標(biāo)記物NeuN檢測神經(jīng)元的數(shù)量，進(jìn)而確定神經(jīng)元的損傷程度[11-12]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，2VO術(shù)后3個(gè)月，模型組大鼠大腦皮層和海馬NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)明顯減少，CIG能顯著增加模型大鼠腦組織NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)，改善VD的病理變化，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本課題組以往研究表明，CIG能增高慢性局灶性腦缺血大鼠腦組織血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管新生[2，13]；對(duì)于穹窿-海馬傘切斷模型大鼠，CIG能升高其腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子含量，并且通過促進(jìn)Bcl-2表達(dá)、抑制Bax和細(xì)胞色素C表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡[3，14]。因此，我們推測CIG改善模型大鼠腦組織神經(jīng)元存活機(jī)制可能與增加神經(jīng)營養(yǎng)因子含量和抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。

ChAT能促進(jìn)乙酰膽堿的合成，而乙酰膽堿是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶功能的主要神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)ChAT也可反映膽堿能系統(tǒng)的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，2VO術(shù)后3個(gè)月，模型組大鼠海馬區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，CIG干預(yù)后模型大鼠海馬ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)明顯增加，表明CIG能增加膽堿能神經(jīng)元數(shù)，同時(shí)增加ChAT含量，促進(jìn)乙酰膽堿合成，進(jìn)而改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，為臨床治療VD提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-12-19）

（修回日期：2018-01-08；編輯：華強(qiáng)）