商陸離體再生體系的構建

鄧雯韜，田 宇，謝 琴，肖英粟，蘇 益，藺萬煌

(湖南農業大學植物激素與生長發育湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

商陸(PhytolaccaacinosaRoxb) 為商陸科商陸屬多年生宿根草本植物，是一種傳統的藥用植物[1-3]，也被用于環境修復[4-7]、病蟲害防治[8]和印染業[9]等多個領域。我國野生商陸資源豐富，分布廣泛，具有很高的利用和開發價值。商陸具有富集土壤中多種金屬離子的作用[10-16]，利用商陸礦質營養遺傳資源對改善作物營養特性和土壤修復具有重要意義。開展商陸離體再生體系研究，為商陸礦質營養相關基因功能分析及其遺傳轉化體系的構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

商陸種子的采集，于2016年秋季在湖南農業大學校園周邊荒地采集成熟的商陸漿果，置于水盆中用紗布將漿果中的種子擠出，棄果皮和上浮的種子，收集下沉飽滿的種子于自然條件下風干，存放4 ℃冰箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 離體培養條件

試驗以 MS 為基本培養基，根據試驗目的分別添加不同濃度的植物生長調節劑組合。培養基中瓊脂濃度為0.7%-0.8%,蔗糖濃度為3%,pH為5.8。經121 ℃高壓濕熱滅菌25 min，培養瓶為100 mL三角玻璃瓶，培養溫度為(23±2)℃，光照強度為2 000 Lx，每天光暗周期為14 h/10 h。

1.2.2 外植體的獲取

參考吳豪杰等的方法[17]，取成熟飽滿的商陸種子，用濃硫酸浸泡處理15 min后，以無菌水沖洗4～6次以除去殘留的硫酸，再將種子接種于含MS培養基的培養皿中發芽。首先在黑暗條件下培養3 d，種子萌發后再置于光照下培養2～3周，獲得六葉期的無菌苗作為商陸離體培養的外植體。

1.2.3 愈傷組織的誘導

分別切取商陸無菌苗的葉片(大小約5 mm×5 mm)、葉柄(長約3～5 mm)、幼莖(長約3～5 mm)、莖節(帶腋芽的莖段，長約3～5 mm)和頂芽(長約5～8 mm)，接種到含有不同濃度組合的植物生長調節劑的MS培養基中(表1)進行愈傷組織誘導培養。觀測20 d后愈傷組織生長情況，統計出愈率。

出愈率(%)=長出愈傷組織的個數/接種外植體總數×100%

表1 愈傷組織誘導培養基中植物生長調節劑組成Tab.1 The composition of plant growth regulators in callus induction medium

1.2.4 叢生芽的誘導

分別挑選以幼莖、莖節、葉片、葉柄和頂芽為外植體誘導出來且生長狀況良好的愈傷組織，接種于芽分化培養基中(如表 2)。觀測20 d后叢生芽的生長情況，統計能誘導叢生芽的愈傷組織個數。

叢生芽誘導率(%)=芽分化的外植體個數/接種愈傷組織總數×100%

1.2.5 生根誘導

當叢生芽長至1.5 cm以上時，切下不定芽，分別接種于表3 所示的培養基中進行生根誘導，觀測15 d后試管苗的不定根生長情況，統計生根率。

生根率(%)=生根的試管苗個數/接種的不定芽總數×100%

2 結果與分析

2.1 商陸外植體的選擇和愈傷組織的誘導

選取不同的外植體分別接種于愈傷組織誘導培養基中(見表1)。在培養5 d后可觀察到葉柄、幼莖、莖節和頂芽的切口處有愈傷組織長出，培養8 d后在葉片切口邊緣有愈傷組織長出。愈傷組織生長狀況表明，商陸外植體以幼莖和頂芽出愈時間早，愈傷組織生長良好，而莖節和葉柄誘導的愈傷組織容易褐化變質，以葉片誘導愈傷組織則出愈時間較遲，愈傷組織生長緩慢。

觀測統計培養20 d的愈傷組織生長情況，如表4所示。試驗結果表明，在植物生長調節劑一定濃度范圍內，在同一培養基中誘導的幼莖和頂芽的愈傷組織生長基本一致，愈傷組織生長質量較好，并以培養基②和③的出愈率最高，達到100%。培養基⑤和⑦產生的愈傷組織質地較硬，顏色為綠色。綜合考慮出愈時間、出愈率、愈傷組織生長質量和植物生長調節劑用量，筆者認為培養基③，即MS+6-BA 0.5 mg/L+2.4-D 0.5 mg/L為本試驗中誘導愈傷組織最適宜培養基。

2.2 不同植物生長調節劑組合對叢生芽誘導的影響

將各外植體誘導出的愈傷組織接種于不同的芽分化培養基中，觀察在不同植物生長調節劑濃度組合培養基中芽分化情況。如圖1所示，在本試驗所用各種培養基方案中，以幼莖、莖節、葉片和葉柄為外植體誘導的愈傷組織均無不定芽的產生，盡管幼莖和葉片誘導的愈傷組織生長良好，但仍未觀察到叢生芽的產生。只有以頂芽誘導的愈傷組織才出現芽的分化(圖1a)，并以培養基⑩(MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L)中最易分化出叢生芽，出芽率高達98%。進一步試驗觀察發現，在以頂芽誘導的愈傷組織生長過程中，原外植體頂芽也會繼續生長。只有帶頂芽的愈傷組織轉接到芽分化培養基后才有叢生芽的分化，而不帶頂芽的愈傷組織未發現有芽的分化，即使該愈傷組織由頂芽誘導產生。

2.3 不同植物生長調節劑對試管苗生根的影響

待叢生芽生長至1.5 cm高以上時，從芽基部切下，接種于到生根培養基中進行生根誘導。 結果如表5所示，應用NAA或IBA分別添加到MS、1/2 MS基本培養基中，都能誘導試管苗生根。除培養基生根率較低外，其他各處理的生根率均達到70%以上，且以培養基、和的生根率最高，達到100%。在NAA 0.3～0.8 mg/L濃度范圍內誘導的根生長健壯，氣生根較少，當NAA濃度為1.5 mg/L時，可在培養基表面生長較多的氣生根，且誘導生根時間提前。在相同的濃度條件下，與IBA相比，NAA誘導產生的根更健壯，IBA誘導產生的氣生根多且根生長緩慢。綜合分析表明，以培養基(1/2 MS+NAA 0.3 mg/L)對商陸試管苗生根較為適宜，其試管苗生根情況如圖2。

表4 不同植物生長調節劑濃度組合對愈傷組織誘導的影響Tab.4 Effects of different plant growth regulators ratios on callus induction

注：培養基編號①～⑦參見表1;小寫字母表示α= 0.05水平不同基本培養基處理間差異性顯著。

圖1 叢生芽的分化Fig.1 Differentiation of cluster buds a.頂芽誘導的愈傷組織分化出叢生芽;b.幼莖誘導的愈傷組織;c.莖節誘導的愈傷組織;d.葉片誘導的愈傷組織;e.葉柄誘導的愈傷組織a.Cluster buds induced from apical buds callus;b.Callus from young stem;c.Callus from stem node;d.Callus from lamina;e.Callus from petiole

表5 不同植物生長調節劑配比對誘導生根的影響Tab.5 Effects of different plant growth regulators ratios on induced rooting

注：培養基編號～參見表3;小寫字母表示α=0.05水平不同基本培養基處理間差異性顯著。

圖2 商陸試管苗生根誘導Fig.2 Plantlets rooting induction of Phytolacca acinosa Roxba.培養基誘導生根的正面培養照片；b.表示培養基誘導生根的底部照片a.A positive photo of rooting induction in medium No.17； b.A bottom photo of rooting induction in medium No.17

3 討論

本試驗進行了商陸外植體的篩選、愈傷組織誘導、叢生芽分化和生根誘導等。試驗結果表明，以頂芽和幼莖作為外植體誘導產生愈傷組織質量最佳，其出愈時間早，誘導愈傷組織的適宜培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2.4-D 0.5 mg/L，誘導率達到100%；叢生芽只能從以頂芽產生的愈傷組織中分化出來，叢生芽分化培養基為 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L，誘導率達98%；生根培養基以1/2 MS+NAA 0.3 mg/L為宜，誘導率是100%。

本試驗在誘導愈傷組織的培養基中添加6-BA和2.4-D，在適宜的濃度范圍內可以誘導產生良好的愈傷組織，而2.4-D與KT、6-BA組合也能誘導愈傷組織，與吳豪杰等人[17]所用6-BA 2.0 mg/L+IBA0.4 mg/L不同，而高利臣等[18]主要以6-BA、GA3和 LH的組合以及6-BA、IBA和 LH的組合，張麗珍等[19]得出的最佳葉片誘導愈傷組織培養基是IBA2 mg/L+2,4-D 3 mg/L，鄒利娟等[20]誘導愈傷組織培養基為MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 1.0 mg/L；叢生芽的分化與高利臣等[21]選用的外植體莖尖有相似之處，但適宜芽分化培養基存在差異。

在研究中我們還發現，誘導愈傷組織分化時，培養溫度不宜高于25 ℃，或低于20 ℃。溫度過高誘導出來的愈傷組織容易玻璃化，溫度過低出愈時間推遲。此外，由于商陸外植體本身含有較多的酚類物質，在愈傷組織誘導過程中易發生褐化現象，特別是幼莖、莖節和葉柄作為外植體時更易產生褐化現象，所以在接入到芽分化培養基時需要將褐化部分切除。

此外，幼莖、葉柄均可誘導出生長狀況良好的愈傷組織，但是筆者在本試驗中發現只有頂芽誘導的愈傷組織才能有叢生芽的分化，推測可能是頂芽產生了特定的植物激素促進了愈傷組織叢生芽的分化，這一推測有待進一步驗證。