脾虛對哮喘大鼠脂質(zhì)介質(zhì)水平影響及捏脊法的干預(yù)效應(yīng)研究?

熊 英，樊 璞，沈楚楚，周瑞鵬，陳 驍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

哮喘是兒童最常見的呼吸道疾病，包括過敏原在內(nèi)的有害刺激誘發(fā)急性氣道炎癥而未能及時消退并轉(zhuǎn)為慢性炎癥，是哮喘的重要病理特征,這與哮喘患者體內(nèi)存在內(nèi)源性特異性促炎癥消退介質(zhì)(specialized proresolving mediators，SPMs)調(diào)控障礙、促炎介質(zhì)水平升高密切相關(guān)[1]。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)是研究最多的一類SPMs，能有效對抗促炎介質(zhì)的作用，促進哮喘急性炎癥的消退[2]。

中醫(yī)學(xué)認為，痰飲內(nèi)伏是哮喘發(fā)生的內(nèi)因，脾為生痰之源，為肺之母，小兒脾又常虛，所以脾虛是兒童哮喘的重要病理特點之一[3]。捏脊法是防治兒童哮喘的常用外治法，有較好的臨床效果[4],但其機制尚未見深入研究。本研究旨在觀察脾虛對哮喘大鼠脂質(zhì)介質(zhì)中前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)促炎介質(zhì)及LXA4水平的影響以及捏脊法的干預(yù)效應(yīng)，以期為捏脊法防治兒童哮喘提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性SD大鼠44只，體質(zhì)量(44.72±3.26) g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供(許可證號SCXK(滬)2007-0005)。普通飲食喂養(yǎng)，室溫22±2 ℃，濕度50%～70%，光照適度，通風(fēng)及潔凈程度良好。將SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組8只，哮喘組、脾虛哮喘組、捏脊脾虛哮喘組各12只,大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 藥物、試劑及儀器

脾虛造模所用中藥材由南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部提供。中藥冷水浸泡30 min，常規(guī)煎煮2次合并藥液，濃縮至1 mL/g原藥材。卵蛋白(OVA，Grade V，Sigma公司，貨號A5503)，大鼠LXA4、CysLTs、PGE2酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供)，Rayto RT-6100酶標分析儀、霧化器(江蘇魚躍器械有限公司)。

1.3 脾虛哮喘大鼠模型的建立(圖1)

圖1 脾虛哮喘大鼠模型建立流程

1.3.1 脾虛模型的建立 參考文獻[5]方法建立脾虛模型。以厚樸、枳實、大黃按3∶3∶2的比例濃縮成100%煎劑,1 g/mL隔日灌胃1次,每次1.5 mL/100 g/體質(zhì)量,喂藥當(dāng)日禁食不禁水,次日喂飼不限，喂養(yǎng)44 d。在脾虛造模結(jié)束時，造模大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、食量減少、倦怠少動、飲水增多、肛溫升高等癥狀，符合脾虛證標準。正常對照組和哮喘組以自來水灌胃。

1.3.2 哮喘模型的建立 參考文獻[6]采用OVA致敏和激發(fā)方法建立哮喘模型，在脾虛造模完成后的第1天(實驗第45天)和第8天(實驗第52天)分別腹腔注射OVA/AL(OH)3混合液1.5 mL(內(nèi)含OVA 1 mg, AL(OH)3凝膠1.5 mL) 致敏，脾虛造模后第15天(實驗第59天)始定時給予1% OVA霧化器噴霧激發(fā)，每次30 min，連續(xù)3 d(實驗第59～61天)。當(dāng)激發(fā)時大鼠出現(xiàn)呼吸喘促、點頭、腹肌抽動等呼吸困難癥狀，提示哮喘模型造模成功。正常對照組致敏與激發(fā)均以生理鹽水代替OVA。

1.4 捏脊法干預(yù)

捏脊法操作：一助手以一只手輕撫按大鼠頭部，另一手輕持鼠尾根部將大鼠固定。操作者先以一手四指腹面輕撫大鼠脊柱中央背部皮膚，從大椎至脊中線尾根部共3遍；而后以雙手拇食指緊靠，輕輕對稱提起大鼠背部沿中線兩側(cè)的皮膚，以指腹相對用力，從脊中線尾根部一直捏至大椎穴處共7遍，接著用四指齊捏背部中線兩側(cè)皮膚，從尾根部至大椎穴捏三提一，重點在肺俞、脾俞共3遍，力量以大鼠不尖叫且較平靜為度。操作中涉及的穴位按《實驗針灸學(xué)》[7]比照人體穴位選取。捏脊法干預(yù)從實驗的第10天始，持續(xù)到哮喘造模OVA激發(fā)前的第58天，其中OVA致敏前為每周一三五日各操作1次，OVA致敏期間的2周為每日操作1次。

1.5 大鼠體質(zhì)量變化趨勢及一般狀態(tài)觀察

脾虛造模過程中，觀察大鼠體質(zhì)量變化、食量、飲水量和肛溫的變化及活動情況等，哮喘造模時觀察大鼠呼吸頻率、腹肌運動情況等。

1.6 大鼠肺組織病理學(xué)觀察

除正常對照組在生理鹽水末次激發(fā)后18 h隨機選取6只取材，其余每組在OVA末次激發(fā)后按隨機數(shù)字表法分為18 h和42 h組，每個時間段6只，25%烏拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，迅速開胸、結(jié)扎并取出右肺上葉，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片、HE染色，光鏡下觀察。

1.7 ELISA檢測大鼠肺泡灌洗液中LXA4、PGE2、CysLTs水平

25%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，開胸結(jié)扎右肺葉后，將灌胃針連接于注射器，將2.5 mL生理鹽水緩慢注入氣管和左側(cè)肺中，立即緩慢抽回，再將所得液體緩緩注回肺內(nèi)，如此反復(fù)3次，最后1次邊回抽邊將注射器緩緩拔出，將灌洗液盛入塑料離心管，此為第1次灌洗，然后重復(fù)3次上述操作，并將離心管置于冰盒中。然后以4 ℃、2000 r/min離心10 min，取上清液進行ELISA檢測，檢測嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明進行，測定吸光度值并換算成濃度水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

圖2 各組大鼠體質(zhì)量增長趨勢比較

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量增長趨勢比較

圖2顯示，從實驗整個過程的體質(zhì)量變化趨勢來看，脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組體質(zhì)量增長速度顯著緩于正常對照組(P<0.01)，捏脊脾虛哮喘組體質(zhì)量增長速度顯著優(yōu)于脾虛哮喘組(P<0.05)。在哮喘造模結(jié)束時(第9周)，哮喘組體質(zhì)量較正常對照組有顯著下降(P<0.01)，捏脊脾虛哮喘組體質(zhì)量顯著高于脾虛哮喘組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化

圖3顯示，正常對照組可見支氣管管壁和伴行動脈周圍有稍許炎性細胞浸潤，支氣管管腔光滑，無炎性分泌物。哮喘組(18 h后)氣道壁變粗，氣道平滑肌增厚，支氣管管壁和伴行動脈周圍有較多的炎性細胞浸潤，杯狀細胞增生，氣道腔內(nèi)可見炎性分泌物；哮喘組(42 h后)相對于哮喘組(18 h后)氣道管壁和動脈周圍炎性細胞浸潤有所減輕，炎性分泌物有所減少。脾虛哮喘組(18 h后)炎性細胞浸潤比哮喘組(18 h后)更顯著，支氣管管壁顯著增厚，炎性分泌物增多；脾虛哮喘組(42 h后)與脾虛哮喘組(18 h后)比較，炎性程度變化不明顯。捏脊脾虛哮喘組(18 h后)的炎性病理變化程度比脾虛哮喘組減輕，與哮喘組相似；捏脊脾虛哮喘組(42 h后)的氣道管壁厚度及其動脈周圍炎性細胞浸潤的程度比捏脊脾虛哮喘組(18 h后)有所減輕。

圖3 肺組織HE染色比較(哮喘造模后18和42 h) (×200)

2.3 各組大鼠BALF中PGE2、CysLTs和LXA4水平的變化

表1顯示，與正常對照組比較，在哮喘造模結(jié)束后18 h和42 h，哮喘組、脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組的PGE2水平均明顯上升(P<0.01)，且42 h水平均顯著高于18 h(P<0.01)。與哮喘組比較，在哮喘造模結(jié)束后18 h，脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組PGE2水平均顯著上升(P<0.01)；在42 h時，脾虛哮喘組水平仍顯著升高(P<0.01)，而捏脊脾虛哮喘組水平升高不顯著(P>0.05)，且顯著低于脾虛哮喘組(P<0.01)。與正常對照組比較，哮喘組、脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組的CysLTs水平均明顯上升(P<0.01)，且42 h水平顯著高于18 h時(P<0.01)；但脾虛哮喘組、捏脊脾虛哮喘組和哮喘組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組BALF中各脂質(zhì)介質(zhì)水平變化比較

注：與正常對照組比較：△△P<0.01；與哮喘組(18 h后)比較：▼▼P<0.01；與脾虛哮喘組(18 h后)比較：＊＊P<0.01；與哮喘組(42 h后)比較：☆☆P<0.01,☆P<0.05；與脾虛哮喘組(42 h后)比較：★★P<0.01,★P<0.05；與捏脊脾虛哮喘組(18 h后)比較：◇◇P<0.01

與正常對照組比較，在哮喘造模結(jié)束后，哮喘組、脾虛哮喘組和捏脊脾虛哮喘組的LXA4水平上升顯著(P<0.01)，且42 h時水平均顯著高于18 h時(P<0.01)，哮喘組LXA4/CysLTs比值雖有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在哮喘造模結(jié)束后42 h時，脾虛哮喘組LXA4水平顯著低于哮喘組和捏脊脾虛哮喘組(P<0.05，P<0.01)，LXA4/CysLTs比值顯著低于哮喘組和捏脊脾虛哮喘組(P<0.01，P<0.05)，且顯著低于18 h；捏脊脾虛哮喘組LXA4水平高于哮喘組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

LXA4是SPMs中研究最多的一類，廣泛表達于上皮細胞、中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞等，能限制或阻止中性粒細胞的浸潤，對抗調(diào)節(jié)PGE2和CysLTs，因此與哮喘密切相關(guān)，并能調(diào)節(jié)細胞因子，有助于哮喘的炎癥消退[2]。研究顯示，哮喘患兒有系統(tǒng)性和氣管組織的LXA4水平明顯下降[8]，嚴重哮喘患者的外周血和BALF中LXA4水平下降，LXA4/CysLTs的比例明顯下降[9]。本研究結(jié)果顯示，哮喘大鼠肺部出現(xiàn)炎癥的同時，LXA4與CysLTs、PGE2水平均明顯升高，而LXA4/CysLTs的比值雖有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著LXA4水平的升高，哮喘炎癥有緩解的趨勢。但脾虛使哮喘大鼠的CysLTs、PGE2水平更顯著升高，雖LXA4水平也在升高，但其升高幅度受影響，因此LXA4/CysLTs的比值顯著下降，哮喘的炎癥程度加重。與肺組織病理表現(xiàn)結(jié)合來看，本研究提示脾虛可能導(dǎo)致炎癥消退的延遲。

中醫(yī)學(xué)認為脾為生痰之源，肺為貯痰之器，脾失健運、痰飲內(nèi)生、伏藏于肺成為哮喘的夙根。且小兒脾常虛，脾為肺之母，脾土不足也常累及肺，所以脾虛是兒童哮喘的重要病理特點之一[3]。近年研究顯示，脾虛動物模型和患者多存在慢性炎癥[10]，結(jié)合此研究的結(jié)果提示脾虛可能影響炎癥的消退導(dǎo)致“伏痰”的產(chǎn)生，成為哮喘發(fā)生的重要病理機制。

捏脊法是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，運用捏、提、捻、推手法刺激人體背部皮膚，從而防治疾病的一種外治方法。捏脊法主要循督脈和足太陽膀胱經(jīng)操作，有調(diào)陰陽、培元氣、和臟腑的作用，尤善健脾[11]，故又被稱為“捏積法”。捏脊法由于易被兒童和家長所接受，也是中醫(yī)防治兒童哮喘的常用干預(yù)手段，有較好的臨床效果[4]。本研究結(jié)果顯示，捏脊法不但有助于改善脾虛體質(zhì)量增長緩慢的狀況，而且有助于明顯提升脾虛哮喘LXA4水平，降低CysLTs、PGE2水平，使LXA4/CysLTs的比值顯著上升，有助于緩解肺部炎癥。有研究表明，捏脊法可降低海馬中與炎癥相關(guān)的基因表達[12]。結(jié)合本研究結(jié)果提示，捏脊法可能通過提升LXA4水平促進機體炎癥消退，這可能是捏脊法健脾祛伏痰防治兒童哮喘的重要機制之一。

4 結(jié)論

本研究表明，脾虛加重哮喘的肺部炎癥程度，并有減緩炎癥消退的趨勢。捏脊法有助于改善脾虛癥狀，減輕脾虛哮喘的肺部炎癥，并促進炎癥的消退，這與其提升LXA4水平有一定的關(guān)系，可能是捏脊法防治兒童哮喘的重要機制之一。