改良硫酸—蒽酮法測定雙黃連粉針劑中總糖的含量

馮文軍　李文春　解黎雯　李殿明　付饒

摘 要：目的：建立雙黃連粉針劑中總糖的含量測定方法。方法：以葡萄糖為對照品，以改良硫酸-蒽酮分光光度法測定雙黃連粉針劑糖總糖的含量。結(jié)果：供試液在50分鐘內(nèi)顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，平均回收率為99.88%，RSD為1.83%。雙黃連粉針劑總糖含量為37.72%。結(jié)論：該方法簡便，快速，測定結(jié)果客觀，準確。

關鍵詞：雙黃連粉針劑；總糖；含量測定；改良硫酸-蒽酮法

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）13-0186-03

根據(jù)中藥注射劑安全性再評價的相關要求，《中藥注射劑安全性再評價質(zhì)量可控性評價技術原則》（征求意見稿）明確指出：“多成份制成的注射劑結(jié)構明確成分的含量因品種而異；所測各類成分之和應盡可能大于總固體的80%。”“多成份制成的注射劑，含測指標的選擇應為大類成份含測加單一成份含測，如：某注射劑中含黃酮、皂苷、生物堿等，需要分別建立總黃酮、總皂苷、總生物堿類的測定，還需分別對黃酮、皂苷、生物堿中的單一代表成份進行含量含測（HPLC或GC法等）。”因此建立雙黃連粉針劑的總糖含量測定指標，以加強制劑質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

METTLER XS205型 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（瑞士）公司）；TU-1901型 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；取液器（Eppendorf Research，0.2mL、1mL、5mL）；具塞玻璃試管（10mL）；石英比色杯；D-葡萄糖（分析純，北京益利精細化學品有限公司）；蒽酮（分析純，中國上海五聯(lián)化工廠）；硫酸（分析純，吉林威龍化學試劑有限公司）；0.2%蒽酮硫酸溶液[稱取0.2g蒽酮，溶于濃硫酸（98%）100mL中，冷卻至室溫，貯于具塞棕色瓶內(nèi)（臨用現(xiàn)配）]；雙黃連粉針劑（哈藥集團中藥二廠，噴干，規(guī)格：0.6g，0903237、0903238、0903239、1001230、1001231、1001232、1005206、1005207、1005208）；注射用雙黃連（哈藥集團中藥二廠，凍干，規(guī)格：0.6g，0902004、0902005、0902006）；注射用雙黃連（哈藥集團中藥二廠，凍干，規(guī)格：1.2g，1002102、1002103、1002104）。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 試驗方法

通過對糖含量方法的反應原理研究，認為硫酸-蒽酮法測定可溶性糖較適合雙黃連粉針劑中總糖的含量測定，研究中該方法有兩種顯色方式[1-2]，即一種在沸水中加熱10分鐘，另一種是應用硫酸加入供試品溶液中發(fā)熱反應顯色稱之為改良硫酸-蒽酮法（硫酸水合熱法），通過文獻認為，改良法較經(jīng)典法更加科學，方便簡單，因此雙黃連粉針劑總糖的含量測定采用改良法硫酸-蒽酮法。

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取葡萄糖100mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻得1mg/mL葡萄糖對照品溶液。精密吸取10mL至100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL 含葡萄糖100μg）。

2.1.2 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置10mL具塞試管中，各加水至2mL，加0.2%蒽酮濃硫酸溶液5mL，搖勻，避光放置30分鐘，以0mL為空白，照分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄ⅤA），在620nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，對照品重量為橫坐標，繪制標準曲線。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2mL置10mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“加0.2%蒽酮濃硫酸溶液5mL……”起依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的重量，計算，即得。

2.2 顯色條件研究

文獻研究得知，顯色的主要因素是硫酸與水的比例，通過設計實驗考察硫酸與水的不同比例，確定最佳的顯色比例。

試驗方法：精密量取對照品溶液0.6mL，分別置10mL具塞試管中，各加水至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，加0.2%蒽酮濃硫酸溶液5mL，搖勻，避光放置30分鐘，同時制備空白，照分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄ⅤA），在620nm的波長處測定吸收度，同時檢測1小時，每10分鐘測一次，記錄結(jié)果。

試驗結(jié)果如表1所示。

通過實驗認為顯色穩(wěn)定性均較好，僅2.5mL時偏差較大，2.0mL時的最大吸收波長與文獻報道620nm一致，且吸收適中因此采用該加水比例顯色。

2.3 最大吸收波長的確定

吸取對照品溶液0.6mL和供試品溶液2.0mL分別置10mL具塞試管中，各加水至2mL，加0.2%蒽酮濃硫酸溶液5mL，搖勻，避光放置30分鐘，以水2.0mL如上法操作得空白溶液，于紫外可見分光光度計上，在400～800nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果對照品溶液在620.5nm波長處均有最大吸收，由于成品中含有多種糖故最大吸收與葡萄糖有差異，600.5nm，但其吸收在600-620nm之間幾乎為平臺變化很小，我們采用葡萄糖為標品，故確定測定葡萄糖的最大吸收波長620nm為檢測波長。葡萄糖對照品紫外圖譜如圖1所示，雙黃連粉針供試品溶液紫外圖譜如圖2所示。

2.4 線性關系的考察

研究方法：精密稱取葡萄糖12.5mg，置100mL量瓶中，加水適量，使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL含葡萄糖0.10mg）。照2.1.2項下方法繪制標準曲線。以對照品量為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為：Y=5.14433X-0.04034，相關系數(shù)為：r=0.9988。表明黃芩苷在0.025mg～ 0.125mg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取注射用雙黃連（凍干）1002102，精密稱定，2.1.3項下方法制備供試品溶液。依法進行測定6次。測定吸收值，結(jié)果平均值為0.3878，RSD=0.11%。由此可見，該方法精密度較好。

2.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

取注射用雙黃連（凍干）1002102，精密稱定，照2.1.3項下方法制備供試品溶液。依法測定，分別在0小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時測定。測定吸收值，結(jié)果平均值為0.3693，RSD=1.63%。該方法雙黃連粉針劑的水溶液，在室溫條件下密閉放置6小時，穩(wěn)定性良好。

2.7 顯色穩(wěn)定性試驗

取注射用雙黃連（凍干）1002102，精密稱定，照2.1.3項下方法制備供試品溶液。依法測定，之后每隔10min測定一次。測定吸收值，結(jié)果平均值為0.4853，RSD=1.16%。該方法50分鐘內(nèi)顯色穩(wěn)定性較好。但隨時間延長吸收度略有降低趨勢，因此建議30分鐘內(nèi)測定完成。

2.8 重復性試驗

取注射用雙黃連（凍干）1002102，精密稱定6份，每份與約10mg，照2.1.3項下方法制備6份供試品溶液。依法測定。測定含量值，結(jié)果含量均值為38.725%，RSD=2.42%。由此可見，該方法重復性較好。

2.9 回收率試驗

取注射用雙黃連（凍干）1002102，精密稱定6份，每份與約5mg，同時各精密吸取葡萄糖對照品溶液（相當葡萄糖2.10mg），分別加入上述6個量瓶中，照2.1.3項下方法制備6個供試品溶液。依法進行測定。測定結(jié)果見表2。

由此可見，該方法加樣回收率較好。

2.10 樣品測定

分別依照2.1項下規(guī)定的方法進行測定。通過15批（凍干6批、噴干9批）雙黃連粉針劑的含量測定，15批粉針的總糖平均含量為37.72%。結(jié)果見表3。

3 討論

（1）張純等[3]報道經(jīng)典的硫酸蒽酮法的反應條件100℃下，反應時間10min，測定波長620nm。在采用該法測定牛膝多糖時發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長并不在620nm處，并時常碰到波峰的漂移情況。引起測定結(jié)果的誤差。反應溫度是導致波峰漂移的主要原因，隨著反應溫度的升高，最大吸收波長向短波長方向漂移。這可能與溫度升高后，糖醛衍生物與蒽酮縮合鏈增長有關。但筆者研究發(fā)現(xiàn)，改良硫酸-蒽酮法（硫酸水合熱法）隨著加水量減少最大吸收波長向短波長方向漂移。但加水量固定，顯色穩(wěn)定快速。雙黃連中的總糖顯色也與葡萄糖略有差別，可能是雙黃連中含有多種糖的原因。（2）蒽酮法的靈敏度較高需要較少的樣品即可達到含量測定的目的，更適合對混合糖的總糖含量測定，雙黃連粉針劑中根據(jù)研究[4]糖類成分超過20%，其中含量較大的有果糖、葡萄糖、蔗糖（非還原糖），另還含有赤蘚醇、鼠李糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、甘露糖、D-半乳糖、肌醇、甘露醇、山梨糖醇等。采用改良硫酸蒽酮法測定雙黃連中的總糖應具有可行性。

參考文獻

[1]丁禮琴，劉力，徐德生.蒽酮-硫酸法測定生地黃提取物中總糖的含量[J].上海醫(yī)藥，2008，29（8）：368-370.

[2]林炎坤.常用的幾種蒽酮比色定糖法的比較和改進[J].植物生理學通訊，1989，（4）：53-55.

[3]張純，郭文彪，王雯佶，等.改良硫酸蒽酮比色法測定牛膝多糖的含量[J].中華臨床醫(yī)藥雜志，2004，4（19）：17-18.

[4]中國藥品生物制品檢定所中藥與民族藥檢驗檢測中心.注射用雙黃連（凍干）化學成分研究報告[R].2010年1月，哈藥集團中藥二廠內(nèi)部資料.