Aβ25—35誘導PC12細胞凋亡影響

蔡弘揚　王晉

摘 要：目的： 觀察Wnt3a對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響。方法：以Aβ25-35 （30 μmol/L）誘導PC12 細胞氧化應激損傷，MTT法測定細胞的存活率，倒置顯微鏡觀察細胞的形態。結果：在PC12細胞的培養過程中，采用MTT法測定細胞的存活率，PC12 細胞依賴Wnt3a濃度的增加而存活率升高，在濃度100 ng/ml時達到最佳值。結論：Wnt3a對Aβ25-35誘導的PC12 細胞損傷具有保護作用。

關鍵詞：Wnt3a PC細胞 細胞損傷 氧化應激

中圖分類號R285 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2018）07-0-02

隨著社會老齡化進程的加快，阿爾茨海默病（AD）的發病率和發病人數急劇上升。傳統的藥物治療，如使用改善腦循環藥物、能量代謝促進劑、乙酰膽堿酯酶抑制劑等，療效有限[1]。因而，研究AD發病機制，并針對病因進行分子水平的治療，將成為改善阿爾茨海默病癥狀、治愈AD的新思路。

神經損傷及凋亡是阿爾茨海默病的病理機制，氧化應激損傷在神經退行性病變中具有重要的病因學意義[2]。研究表明，線粒體裂變或者聚變，都可以對細胞產生氧化損傷[3]，也可能產生局部生物能量的缺乏。目前，已有較多的證據表明，線粒體形態的異常或功能的缺陷，會導致神經細胞的損傷或者死亡。因而，線粒體作為細胞的一個中央細胞器是潛在治療AD的新靶點[4]。但是，在AD的發病機制中，是否與一些線粒體功能的缺陷而導致的發病存在聯系，尚不清楚[5]。

一、材料和方法

1.材料

1.1細胞大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞來自中國科學院細胞所。

1.2試劑：DMEM培養基（ Gibcol），胎牛血清（ 四季青），Wnt3α（Sigma）

2.方法

2.1 PC-12細胞的體外培養 PC-12細胞接種于培養瓶，置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。完全培養基為DMEM添加15%小牛血清。每3 d換液1次，3～4 d以1：5進行傳代。

2.2 PC-12細胞的Aβ25-35誘導和Wnt信號通路干擾 Aβ25-35 （Sigma）100 ?mol/L，過濾并分裝后，貯存于-20℃。使用前在37℃溫箱孵育7天，并用新鮮的完全培養基稀釋為工作濃度10 ?mol/L、20 ?mol/L、 30 ?mol/L、40?mol/L和50 ?mol/L。對數生長期的PC-12細胞，消化并離心收集后，重懸在完全培養基中，以5×105/cm2的密度接種在培養瓶和六孔板表面生長。待細胞長至80%融合時，去除培養基，并加入新鮮培養基，其中含梯度濃度（10～50?mol/L）Aβ25-35，置于上述條件的培養箱中培養。加藥24 h，收集細胞進行檢測。為了觀察Wnt信號通路及線粒體的缺陷的影響，確定實驗Aβ25-35 30 ?mol/L培養基中加入經典Wnt通路的激活Wnt3a 50 ng/ml、100 ng/ml 和200 ng/ml，48 h以后收集細胞進行觀察和檢測。

2.3按照處理因素對細胞分組

實驗設4組，每組6個樣本（n=6）。各組處理如下。組1使用完全培養基；組2使用完全培養基+Aβ25-35 30 ?mol/L+ Wnt3a 50 ng/ml；組3為完全培養基+Aβ25-35 30?mol/L+Wnt3a 100 ng/ml；組4為完全培養基+Aβ25-35 30 ?mol/L+ Wnt3a 200 ng/ml。

2.4 用新鮮配制RPMI1640培養基把細胞配制成單個細胞懸液，在96孔培養板中接種，每孔5×104個細胞200?l量，并設置平行孔。2.5向實驗組中分解加入同上分組Wnt3a的劑量，在對照組應加入同等量的生理鹽水。加藥后經過12h、24h、36h、48h分別作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不棄去培養基的條件下，放入37℃和5%CO2孵育箱內孵育4小時，等待檢測。將每組每孔細胞均勻輕輕細細吹打，混勻，移入1.5mlEP管中，離心，再在每孔中加入二甲基亞砜150?l，輕輕搖蕩10min，使其完全得到溶解。然后將混合液再次置入96孔板中，將96孔板放入酶標儀中，選擇波長490nm處，檢測各孔的光吸收值，記錄結果并把結果打印。根據該結果計算增殖抑制率，抑制率=（1-實驗組值/對照組值）×100%來實現的，根據增殖抑制率的結果得出細胞的最適作用濃度和最適作用時間。

二、結果

我們采用大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞株建立AD細胞模型。體外培養的PC12細胞，對實驗中的各項檢測，均選取低代數（小于P5）、對數生長期細胞進行分離培養和藥物處理。

本實驗采用順梯度濃度的Aβ25-35與 PC12 細胞共培養孵育24 h， Fig. 1A 所示細胞活力隨著Aβ25-35濃度的遞增而降低，結合細胞形態觀察，本實驗選取30?mol/L作為Aβ25-35誘導AD細胞模型的適宜濃度，及進行后續研究。

細胞接種 24 h 后除對照組外其余均加入30 μmol/LAβ25-35，同時除建造的AD模型組外其余加入不同濃度（ 50、100、200 ng/ml） Wnt3a 48 h， 如 Fig. 1B 所示PC12 細胞依賴Wnt3a濃度的增加而存活率升高，在濃度100 ng/ml時達到最佳值。

Fig.1

MTT法測定PC12細胞凋亡（ n = 6）. *P < 0. 05， **P< 0. 01 vs 對照組（Aβ25-35= 0）.

結合細胞形態觀察，本實驗選取30?mol/L作為Aβ25-35誘導AD細胞模型的適宜濃度。在此實驗中，建立AD模型的PC12 細胞通常在接種24 h時開始接受處理，即：去除原培養基，更換為含Aβ25-35（30 mol/L）的新鮮培養基，持續作用24 h，每個實驗組分別加50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml Wnt3a持續到48 h。觀察細胞形態及生長情況如圖（Fig.2）。

A AD模型 B AD+wnt3a（50ng/ml） C AD+wnt3a（100ng/ml） D AD+wnt3a（200ng/ml）

Fig.2：PC12在倒置顯微鏡下細胞形態

三、討論

阿爾茨海默病（AD）是一種進行性神經退行性疾病，臨床表現包括進行性記憶減退，認知功能障礙等，并伴有機體內大量的大腦皮質和海馬區神經細胞的丟失。機體在新陳代謝過程中持續生成各種類型的氧自由基代謝產物，并且通過各種抗氧化酶將自由基進行清除，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶等。此外，各種環境污染物、紫外線照射等也是氧自由基的重要來源[6]。機體的氧化損傷即機體內產生的氧自由基得不到及時清除，導致活性氧在體內堆積引起細胞毒性，是機體各組織老化的重要誘因。AD 病人體內自由基生成增加，尤其是腦組織中神經細胞的氧化應激是導致其腦結構和功能改變的原因之一[7]。

基于上述討論，我們推測AD發病中，線粒體的缺失或者異常導致細胞的氧化損傷，以至于導致細胞的凋亡。通過影響Wnt信號通路，改變Aβ對細胞的毒性作用，以減少對細胞的氧化損傷。其中，Wnt信號通路中的wnt3a蛋白發揮著主要作用。

Aβ是AD發病的始動因素，長期以來也是AD治療的重要靶標。一方面Aβ能夠影響細胞骨架的完整性。另一方面，Aβ的細胞毒性作用可能干擾線粒體的功能障礙，β-淀粉樣蛋白積聚而成的毒性肽鏈與過氧化氫酶相互作用，令過氧化氫酶喪失正常功能，導致培養基內的神經細胞受到氧化損傷如圖（Fig.1 、Fig.2）。

本實驗利用MTT法檢測細胞的增殖活力間接測線粒體酶的活力反映細胞活力， 結果表明濃度超過20?mol/L Aβ25-35與 PC12 細胞孵育 24 h 能明顯抑制WST-1代謝率，說明Aβ25-35釋放毒性對細胞線粒體功能造成障礙；Wnt3a能濃度依賴性改善WST-1代謝率，在Wnt3a100ng/ml達到最佳值， 表明Wnt3a對Aβ25-35釋放毒性造成的線粒體損傷具有保護作用（Fig.1），形態學觀察表明30?mol/L Aβ25-35與 PC12 細胞孵育24 h 細胞形態發生改變有菱形變成了扁形，表明細胞發生損傷； Wnt3a在50 ng/ml和100 ng/ml細胞的形態明顯得到了改善，表明Wnt3a能增加存活細胞數目如圖（Fig.2）。

氧化應激理論認為，由細胞內的線粒體經呼吸作用產生的天然副產物——不斷積累的有害性活性氧自由基（ROS）不但可損害各種分子（包括蛋白質、脂質與核酸），而且還會隨著時間的積累對細胞功能產生有害影響[8]。近期研究表明，有一條路徑機制與淀粉樣蛋白無關。“壞的”ApoE4會分解形成有毒的碎片，這些碎片會搗毀細胞的能量工廠—線粒體—從而改變細胞構架。

雖然究竟什么才是最終引起細胞凋亡及死亡的特異性生物化學事件依然存在爭議，但是我們已經知道的是，在細胞培養中，如果找到存在的適當濃度的“矯正”分子，就會減少線粒體的損害以及神經元紊亂的發生。目前，研究者正在動物模型中對這些分子進行更加嚴格的檢測。如果最終證明這些分子在人體內是安全和有效的，那么我們就終于看到了曙光。

參考文獻

[1]Hardy J ， Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimers disease： progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science， 2002，297： 353-356.

[2]Maxwell SR. Prospects for the use of antioxidant therapies[J].Drugs，1995，49：345-361.

[3]KageyamaY， Zhang Z， Roda R.， et al. （2012）. Mitochondrial division ensures the survival of postmitotic neurons by suppressing oxidative damage. J. Cell Biol. 197， 535–551.

[4]Lin M.， Beal F.. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature 2006 443， 787–795.

[5]張大鵬，王奇.阿爾茨海默病發病中淀粉樣β蛋白的神經毒性作用。中國臨床康復，2005. 9（25）：174-176

[6]Itoh K.， Nakamura K.， Iijima M.，et al. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.Trends Cell Biol. 2013.23， 64–71.

[7]黃欣，柳川. 以Aβ為靶標治療阿爾茨海默病的研究進展。生物技術通訊，2005.16（1）：87-89

[8]Chan D. C.. Fussion and Fission： interlinked processes critical for mitochondrial health. Annu. Rev. Genet. 2012.46， 265–280.