毛細管電泳法用于測定大鼠血漿中淫羊藿苷含量的研究

曾 雪，唐 倩，徐穎倩，劉應杰，陳 竹，夏培元

(1.重慶醫藥高等專科學校藥學院 401331；2.陸軍軍醫大學西南醫院藥劑科 400050；3.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院 401121；4.重慶市化學藥品質量控制與評價協同評價中心 401121；5.重慶市藥物制劑工程技術研究中心，重慶 401331)

淫羊藿屬于小檗科，具有補肝腎、強筋骨、祛風濕、抗衰老、抑制腫瘤和提高免疫力等作用。目前，國內外學者已經從淫羊藿屬植物中分離鑒定出具有活性的黃酮類化合物106 種，主要是一類以羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯基等為取代基的 2-苯基色原酮衍生化合物。其中淫羊藿苷在人內體代謝成淫羊藿苷元，對白細胞介素(IL)-8和腫瘤壞死因子α(TNF-α) mRNA的產生有一定抑制作用，并促進機體產生促成骨細胞生長的因子，影響骨細胞的增殖，提高堿性磷酸酶的活性，從而達到治療骨質疏松的目的[1-5]。淫羊藿成分的分析多采用高效液相色譜法(HPLC)，該方法操作步驟多，流動相處理復雜，試劑量消耗大[6-8]。高效毛細管電泳(HPCE)作為一種分離分析技術，具有高靈敏度，高分辨率，緩沖溶液處理簡單，操作簡便等優點，有利于開展復雜生化樣品的分析，目前毛細管電泳技術配合不同的測試手段已經在天然產物化學中開展了的以黃酮化合為主的多項研究[9-11]。本文以HPCE為分析方法，以十二烷基磺酸鈉(SDS)為緩沖溶液添加劑，建立檢測血清中淫羊藿苷代謝物含量的方法[12-15]。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠，雄性，體質量(200±20)g，從重慶醫科大學動物實驗中心購買，給藥前12 h禁食，自由飲水。

1.2儀器與試劑 CL1020高效毛細管電泳儀(紫外檢測器，中國北京彩陸科學儀器有限公司)，GWA-UN1型超純水器(北京普析通用儀器有限公司)，SK-1渦旋混合器(常州國旺儀器制造有限公司)，AUX220電子天平(日本島津)。CQ250 超 聲 波 清 洗 器(上海超聲波儀器廠)，TDG16臺式高速離心機[屹譜儀器制造(上海)有限公司]。淫羊藿苷標準品(有效純度98.0%,批號14110704,美侖生物科技有限公司)，磷酸(分析純，重慶精細化工工廠)；2-丙醇(分析純，重慶精細化工工廠)；乙腈(優級純，天津四友化工有限公司)；十二烷基磺酸鈉(SDS，相對分子質量272.38，美國)；其他實驗試劑均采用分析純。

1.3方法

1.3.1對照品溶液制備 精密稱取淫羊藿對照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻。

1.3.2動物實驗 取6只健康雄性SD大鼠，取對照品溶液灌胃給藥(劑量相當于對照品0.2 mg/100 g)，灌胃后分別于0.15、0.5、1、2、3、4、5、6、8、12 h尾靜脈采血0.2～0.4 mL，置于放有肝素的塑料離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上層血漿置于-20 ℃冰箱中保存備用。再取3只健康雄性SD大鼠，同法處理收集空白血漿備用。

1.3.3血漿樣品處理 取空白血漿3份約0.5 mL于5 mL塑料離心管中,直接加入對照品溶液100 μL，漩渦混合均勻，分別比較乙酸乙酯萃取-甲醇沉淀、甲醇和乙腈直接沉淀兩種處理血漿的電泳圖，最后確定使用乙酸乙酯萃取法-甲醇沉淀的方法處理血漿。

1.3.4樣品淫羊藿苷濃度測定 采用75 μm×67.4 cm石英毛細管柱(有效長度51 cm，河北永年瑞豐色譜配件有限公司)；分離電壓20 kV；進樣方式采用電動進樣，進樣電壓15 kV；進樣時間5 s；操作溫度25 ℃；緩沖溶液20 mmol/L磷酸，100 mmol/LSDS(20%乙腈，2% 2-丙醇)，pH2.0，檢測波長254 nm。

2 結 果

2.1血漿樣品處理方法考察 血漿處理方法有3種，甲醇直接沉淀法，甲醇、乙腈沉淀法，乙酸乙酯沉淀法。甲醇直接沉淀血漿，易出現乳化現象，首先排除。血漿中由于內源性干擾物較多，對比甲醇乙腈沉淀法和乙酸乙酯沉淀法，結果顯示，采用乙酸乙酯萃取后，可明顯減少內源性干擾物(見圖1)。故本試驗先采用乙酸乙酯進行萃取，然后采用甲醇沉淀處理，具體操作：取“1.3.2”項下直接加入淫羊藿苷對照品溶液的空白血漿，加入2.5 mL乙酸乙酯,振蕩萃取3 min,離心(5 000 r/min,5 min),移取上清液,于37 ℃水浴氮氣吹干,殘渣加入100 μL甲醇漩渦振蕩1 min溶解,高速離心(10 000 r/min,2 min),取上清液[11-12]。

2.2采血時間的考察 將“1.3.2”項下的大鼠灌胃給藥后血樣按“1.3.3”項下電泳條件進樣，以成分峰響應值為指標，分析考察血藥濃度達到最大的時間，作為淫羊藿苷代謝物含量測定時間(見圖2)，結果顯示，給藥后3 h后，血藥濃度達到峰值。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性試驗 精密吸取實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液；實驗方法“1.3.2”項下灌胃SD大鼠血漿樣品和“1.3.2”項下空白血漿各0.5 mL，作為對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液，按實驗方法“1.3.3”項下電泳條件進行測定，記錄電泳圖(見圖3)，結果顯示陰性對照沒有干擾峰，而供試品溶液的出峰時間相比對照品溶液有所后移，分析是因為淫羊藿苷在體內代謝成淫羊藿次苷Ⅱ所致。

A:甲醇+乙腈沉淀血漿；B;乙酸乙酯萃取，甲醇沉淀血漿

圖1淫羊藿苷不同處理條件下的血漿HPCE

圖2 6只SD大鼠體內不同時間淫羊藿苷電泳峰面積響應值

2.3.2線性關系考察 取5份空白血漿樣品0.5 mL于10 mL塑料離心管中,依次加入實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液0.01、0.05、0.1、0.5、1 mL漩渦混合均勻,先乙酸乙酯萃取、然后甲醇沉淀，取上清液，得質量濃度為0.002、0.01、0.02、0.1、0.2 mg/mL梯度血漿溶液，按實驗方法“1.3.3”項下條件進行電泳測定，以淫羊藿苷質量濃度為橫坐標(X)，以電泳峰面積為縱坐標(Y)進行回歸計算，得到回歸方程為：Y=127 395X-216 893，r=0.998 7。結果表明，淫羊藿苷在0.12～2.7 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.3精密度試驗 精密吸取實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液0.5 mL與實驗方法“1.3.2”項下空白血漿中，按“結果1”項下方法處理血漿，連續進樣6次，測定電泳峰面積，計算淫羊藿苷峰面積RSD=1.7%。

A:陰性對照；B:對照品溶液；C:供試品溶液

圖3專屬性試驗

2.3.4重復性試驗 另取6只健康雄性SD大鼠，取實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液灌胃給藥，并于給藥后3 h進行尾靜脈采血，按實驗方法“1.3.2”項下要求進行血樣處理，按實驗方法“1.3.3”項下要求進行電泳測定，計算淫羊藿苷峰面積的RSD為3.7%。

2.3.5加樣回收率試驗 按實驗方法“1.3.2”項下方法制備6份血漿樣品各0.5 mL，按實驗方法“1.3.3”項下方法進行電泳測定，記錄6份樣品淫羊藿苷的電泳峰面積；再依次向6份樣品中加入等質量淫羊藿對照品0.2 mg，按實驗方法“1.3.3”項下方法進行電泳測定，記錄6份樣品中淫羊藿峰面積，并計算加樣回收率結果(表1)。

表1 回收率試驗結果(n=6)

2.4含量測定 取3只健康雄性SD大鼠，按實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液灌胃給藥(劑量相當于對照品0.2 mg/100 g)，灌胃后3 h采血，并按實驗方法“1.3.2”項下方法處理血漿，按實驗方法“2.3.1”電泳條件測定，測得大鼠體內淫羊藿苷的含量(見表2)。

表2 大鼠體內淫羊藿苷含量

3 討 論

本文研究目的是以HPCE為檢測手段，檢測血清中淫羊藿代謝物的血藥濃度，為淫羊藿的體內藥物分析提供新的方法和檢測途徑。

本文的檢測對象是含藥血液樣本，血液中內源性干擾物多，如果直接進行電泳分析，會導致信噪比降低，目標信號被噪音掩蓋，因此血液樣本的前處理是關鍵，前處理的目的是去除內源性物質同時不會影響目標物的檢測，本文比較了目前常用的3種血液處理方法，最后采用乙酸乙酯萃取血漿，甲醇沉淀的方法，避免樣品乳化現象的同時，降低了內源性干擾物影響，有效提高了信噪比。

本文對大鼠采用灌胃方式給藥，淫羊藿進入體內后受代謝過程影響，血藥濃度呈現連續變化過程，為了準確測定淫羊藿血藥濃度，本試驗連續測定了給藥后12 h的大鼠血藥濃度，確定在灌胃給藥后3 h，血藥濃度達到峰值，以此時間作為采樣時間，可降低檢測結果的相對誤差，保證結果準確度。

淫羊藿苷給藥后，在大鼠體內是以代謝物形式存在，分析代謝物可能是淫羊藿次苷Ⅱ，本文并未采用淫羊藿次苷Ⅱ為對照品，而是采用淫羊藿苷為對照品，比較了淫羊藿苷對照品的電泳圖、空白血清電泳圖和給藥后血清電泳圖，證明了淫羊藿苷在體內代謝后僅僅是出峰時間出現延后，但不妨礙定量分析。

淫羊藿苷及其代謝物分子接近電中性，本文在緩沖溶液中加入SDS，調整pH到2.0，可增加待測組分帶負點能力，克服緩沖溶液電滲流，利于電泳分離。但加樣回收率試驗RSD偏高，分析原因可能是SD大鼠個體差異、給藥方式等多種因素綜合導致含藥量差異偏大。除此之外，進樣方式存在系統誤差，進樣量準確度偏低，最終結果RSD偏高，后期可通過更改進樣方式解決。毛細管電泳方法簡便，試劑消耗量少，與高效液相色譜相比，不需要對流動相進行脫氣和過濾處理，僅采用以磷酸為主的緩沖溶液即可滿足分析要求。在本文中，淫羊藿苷在血漿中的含量隨時間逐漸降低，本文可實現0.12 mg/mL的定量分析，具有較低定量限。同時相比于高效液相色譜，不易堵塞柱子，更適合生化樣本的分析。