丹參凍干粉針對大鼠體內硝苯地平藥動學的影響*

張 華，邱 鎮，陳 紅,陳衛東△

(1.安徽中醫藥大學，合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院/中藥資源保護與開發研究所，合肥 230012；3.馬鞍山十七冶醫院,安徽馬鞍山 243000)

高血壓作為臨床常見慢性疾病之一，是引起心腦血管疾病的一個主要因素。我國高血壓發病率明顯上升，成為世界上高血壓危害最嚴重的國家[1]。硝苯地平是一類長效鈣通道阻滯劑，對血壓控制效果良好，是高血壓患者臨床治療的首選藥物之一[2-3]。丹參是唇形科植物丹參的干燥根和根莖，最初記載于《神農本草經》，被列為上品。現代藥理學研究表明，丹參具有擴張冠狀動脈、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循環、降低心肌耗氧量等作用，在臨床上，廣泛用于心腦血管疾病的治療[4-5]。另外丹參粉具有消除氧自由基、提高一氧化氮(NO)合成釋放、提高纖溶活性的作用，可改善患者病情，減少靶器官損害及并發癥的發生[6]。但二者聯合使用在心血管疾病的治療中是否能產生有益的影響，或者說二者之間有無協同作用，國內尚無相關研究報道。

1 材料與方法

1.1實驗動物 24只健康SD大鼠[由安徽醫科大學實驗動物中心提供；清潔級，合格證號為SCXK(皖)2011-002]，體質量(220±10)g。飼養條件：溫度為(20±2)℃，濕度為(50±5)%，每天12 h光照。適應性飼養2周，自由飲食，進水。實驗前禁食12 h，自由飲水。

1.2儀器與試劑 LC-15C高效液相色譜儀(日本島津)，AB135-S 型十萬分之一電子天平(德國梅特勒-托利多儀器有限公司)，XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)，KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，TG16-WS臺式高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，LC-4016型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，BCD-225CHC冰箱(合肥美菱股份有限公司)。硝苯地平對照品購自中國食品藥品檢定研究院(純度大于99.9%，批號100338-201103)，地西泮對照品購自西安萬昌生物科技有限公司(純度大于99%，批號D-104140403)。 硝苯地平片購自南京白敬宇制藥有限責任公司(批號151101；每片10 mg)，丹參凍干粉針劑購自哈藥集團中藥二廠(批號1601768；400 mg/支)。 甲醇購自上海信可有限公司(色譜純)，超純水為安徽中醫藥大學自制(18.2 Ω)。

1.3方法

1.3.1色譜條件 色譜柱COSMOSIL C18柱(4.6×250 mm，5 mm)，檢測波長235 nm。流動相(B)甲醇-(A)水(55∶45，V/V)，在線脫氣，等度洗脫。流速為1.0 mL/min，柱溫箱設置溫度為30 ℃，進樣定量環為20 μL。

1.3.2給藥方案及血漿樣品采集 按體質量分成4組，每組6只。從實驗第1天到第6天對4組分別進行不同的給藥預處理。對照組：尾靜脈注射生理鹽水；丹參粉針低劑量組：尾靜脈注射20 mg/kg丹參粉針；丹參粉針中劑量組：尾靜脈注射40 mg/kg丹參粉針；丹參粉針高劑量組：尾靜脈注射80 mg/kg丹參粉針。末次給藥后，禁食12 h，自由飲水。實驗第7天，各組大鼠按上述劑量給藥后，立即灌服硝苯地平10 mg/kg。于給藥后0.05、0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24 h由大鼠眼眥取血0.3 mL，立即置于肝素化EP管中，搖勻，3 500 r/min離心10 min以分離血漿，-20 ℃保存，備測。

1.3.3血漿樣品處理 精密移取大鼠血漿90 μL，將其置于1.5 mL具塞離心管中，加入10 μL內標地西泮(濃度為7.76 μg/mL，用甲醇溶解)，再精密加入300 μL甲醇(蛋白沉淀劑)，置渦旋混合儀上渦旋振蕩3 min，混勻后，置于低速離心機中3 500 r/min離心10 min，取全部上清液，過0.22 μm微孔濾膜，取上清液進樣分析。采用內標法，目標峰與內標峰面積的比值進行定量分析。

2 結 果

2.1專屬性考察 取大鼠的供試品、對照品及內標溶液分別按照“1.3.1”項下色譜條件進樣分析，用來考察內標地西泮以及血漿的內源性雜質是否干擾硝苯地平的測定。結果表明，硝苯地平的保留時間為16.7 min，內標地西泮的保留時間為7 min，各色譜峰峰形較好，色譜峰分離度良好，且空白血漿中的內源性雜質及內標地西泮在此條件下沒有干擾硝苯地平的測定。供試品中硝苯地平與對照品中的硝苯地平的保留時間相同，說明該條件特異性較強，方法專屬性較高。

2.2標準曲線與線性范圍 精密吸取不同濃度的硝苯地平標準品溶液，加入內標和空白血漿，配制成含硝苯地平0.8，1.6，3.2，6.4，12.8，25.6，51.2 μg/mL的血漿標準溶液，按“1.3.3”項下方法處理樣品，以血藥濃度(p)為橫坐標，硝苯地平與內標的峰面積比值( Y) 為縱坐標，建立回歸方程，求得硝苯地平的標準曲線方程為Y=0.083 6X+0.073 6，R2=0.998 8，所得結果表明硝苯地平線性范圍為0.8～51.2 μg/mL，且線性關系良好，定量下限(LLOQ)為0.8 g/mL。標準曲線見圖1。

圖1 血漿中硝苯地平的標準曲線(n=7)

2.3精密度與回收率 精取硝苯地平對照液(0.8、1.6、6.4 和38.0 μg/mL)，配制成LLOQ、低、中、高4個濃度的質控樣本溶液，分別按照“1.3.3”方法進樣分析。每個濃度平行6個樣本，連續測定3 d(每天重新配制樣品)，計算日內和日間精密度(表1)。

2.4穩定性 按“1.3.3”項下方法配制LLOQ、低中高(0.8、1.6、6.4 和38.0 μg/mL)4個質量濃度的硝苯地平血漿樣品，考察血樣在室溫條件下于0、2、4、8、12、24 h內放置的穩定性。另外還考察放置于-20 ℃冰箱凍存，先后兩次將血漿樣品取出的血漿樣品穩定性。各條件下每一濃度平行6份，經測定各濃度的RSD值均小于10%。說明上述條件下各血漿樣品穩定性良好。

2.5藥動學參數分析

2.5.1血藥濃度-時間曲線 根據所得的血藥濃度數據結果，繪制各組血藥濃度-時間曲線；使用DAS 2.0軟件對所測得各血藥濃度數據進行擬合，其參數結果如圖2所示。

2.5.2統計矩參數 從藥時曲線結果可知，聯合使用的中劑量組曲線上的點均大于對照組的濃度，且丹參凍干粉針劑對大鼠體內硝苯地平的血藥濃度是增加的。從上表可以看出低劑量、中劑量、高劑量實驗組的平均駐留時間[MRT(0→∞)]分別為685.363±192.728、799.976±394.869、599.533±127.471，各實驗組均明顯大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05；P<0.01)，見表2。

圖2 藥時曲線

標示濃度(μg/mL)日內平均值(x±s)RSD(%)日間平均值(x±s)RSD(%)0.80.813±0.0202.440.803±0.15319.101.61.579±0.0704.451.611±0.17310.766.46.406±0.82512.886.383±0.4687.3338.037.825±0.5671.5038.482±3.6129.39

表2 大鼠的統計距參數

*：P<0.05;*：P<0.01,與對照組比較

3 討 論

根據藥典可知，硝苯地平為疏水性成分，甲醇、乙腈是蛋白沉淀法常用的有機溶劑，用甲醇的優點是上清液澄清,沉淀為絮狀且易于分離，血漿雜質峰少，重現性好[7-9]，故選用操作簡便、對操作者傷害小、成本較低、適合于大批量生物樣品處理的蛋白沉淀法對血漿生物樣品進行前處理[10-11]。

本實驗采用常用的流動相甲醇-水，并以甲醇-水(55∶45)作為使用比例，根據文獻[12-14]流動相甲醇-水(60∶40)的參考，又因甲醇-水(50∶50)沖洗柱子出峰時間快，但黏度大、避免使用，綜合考慮樣品出峰時間和安全性問題，最終確定以甲醇-水(55∶45)比例制備流動相。

根據內標物選擇的要求，因為地西泮具有鎮靜、抗焦慮和一定的抗心律失常作用，能有效改善硝苯地平體位性低血壓的不良反應[15]，結合樣品出峰時間的考慮，地西泮出峰時間較早，總分析時間僅7 min，優化了整體出峰時間，本實驗確定用地西泮作為內標物質。

通過硝苯地平聯合丹參凍干粉針用藥的實驗組(丹參低劑量組、臨床等效量組、高劑量組)與對照組對比，發現實驗組MRT(0→∞)數值均高于生理鹽水組，表明丹參可以增加硝苯地平在體內的平均駐留時間。MRT是藥物在體內的平均駐留時間，靜脈推注一定量藥物后，藥物分子分布于全身各處，這些藥物分子于體內滯留時間不等[16]。平均駐留時間是一個總體行為的特征，它是每一個分子滯留時間的平均值，也是非常重要的藥動學參數[17]。本實驗聯合丹參凍干粉針劑使用的實驗組的MRT(0→∞)均較對照組有顯著增加，可能減慢硝苯地平的體內消除，對硝苯地平的代謝可能具有一定的抑制作用。

通過實驗組t1/2z數值的比較，發現高劑量組t1/2z數值明顯低于中、低劑量組，可能是過高濃度的丹參溶液會誘導硝苯地平在體內的代謝。后期可能還需要從能夠影響硝苯地平體內消除過程的其他代謝酶或轉運蛋白角度設計進一步的實驗，以期可以闡明丹參凍干粉針劑對大鼠體內硝苯地平消除過程產生影響的機制。

本實驗建立了靈敏檢測大鼠體內硝苯地平的血漿生物樣品分析方法——HPLC法，該方法符合生物樣品分析要求。在實驗中實驗方法的確立、樣品的處理、試劑與樣品的穩定性實驗等操作，體現了實驗的嚴謹、消除了存放時間、貯存溫度對實驗結論的影響。

本實驗以不同劑量丹參凍干粉針劑對硝苯地平影響，所得血藥濃度作比較，對聯合用藥時丹參凍干粉針對硝苯地平的藥動學參數的影響進行了初步研究。在多次給藥中建立了連續7 d注射不同劑量丹參的3個實驗組及注射生理鹽水的對照組。結果顯示在聯合使用丹參凍干粉針時實驗組大鼠體內硝苯地平的平均駐留時間均有所提高，具體為低、中、高劑量組的MRT(0→∞)與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)，但實驗組其他藥動學參數與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。