米諾環素促進PC12細胞氧糖剝奪/復氧后神經突生長及機制研究*

楊 洋，陶 濤，付 潔，何曉英，李小剛

(西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川瀘州 646000)

缺血性卒中是成人致殘最主要的原因，大多數腦梗死患者殘留嚴重而持久的神經功能缺損。腦梗死后神經再生和神經可塑性是當今神經科學研究的熱點。目前認為受損神經元的軸突再生和突觸形成與神經功能恢復密切相關，中樞神經系統損傷后神經元信息網絡整合功能的重建，形成新的神經環路，可促進神經功能的恢復。米諾環素是一種第二代半合成的四環素類抗生素，被認為是目前最有前途的神經保護劑。動物研究表明，米諾環素可促進大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經元軸突再生[1]，近期一項臨床研究顯示，急性缺血性卒中患者早期使用米諾環素可促進患者神經功能的恢復[2]。本課題組前期的體外研究表明，米諾環素對PC12細胞氧糖剝奪損傷具有保護作用，可以顯著提高細胞的存活率且促進神經突的生長[3]，但其具體機制尚不明確。肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)是Rho激酶(ROCK)的下游底物之一，活化的ROCK滅活MLCP，使其不能水解MLC的磷酸基團，從而提高細胞內MLC的磷酸化水平，導致生長錐的崩解及軸突回縮[4]。所以本研究旨在觀察米諾環素對氧糖剝奪/復氧后PC12細胞神經突生長的影響，并探討MLCP/MLC信號通路對神經突生長的調節作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 PC12細胞高分化細胞株(中科院上海細胞庫)，DMEM無糖培養基(Gibco公司)，鹽酸米諾環素(美國Sigma公司)，MLCP抑制劑Calyculin A、兔抗MLC和兔抗p-MLC(美國CST公司)，兔抗MAP-2及小鼠抗GAPDH(美國Santa Cruz公司)，Dylight標記山羊抗兔抗體(碧云天生物公司)。其他試劑均購于相應代理商。

1.2PC12細胞的傳代培養 體外培養PC12細胞，每3天換液1次，待細胞長滿80%～90%時，用0.25%胰酶消化后，以1∶3進行傳代培養，取第7～9代細胞進行實驗。取生長狀態良好的細胞，用DMEM培養液吹打成細胞懸液，計數后分別以5×104/孔的細胞密度接種在96孔板，4×105/孔接種在24孔板，2×106/孔接種在75 cm2的培養瓶，置于37 ℃ 5% CO2恒溫孵箱內培養。

1.3氧糖剝奪/復氧模型的建立 參照本課題組前期報道的方法[5]，先去掉培養液，PBS清洗3次后，加入不含血清的DMEM無糖培養基，置于含94% N2，1% O2和5% CO2的孵箱中培養，6 h后更換成DMEM高糖培養基，置于含5% CO2的正常氧孵箱中繼續培養24 h。

1.4實驗分組 將PC12細胞隨機分為正常組、模型組、米諾環素組(MC組)和MLCP抑制劑組(Cal組)。正常組不進行任何處理；模型組采取氧糖剝奪6 h再復氧24 h；米諾環素組在氧糖剝奪及復氧全過程中加入1 μmol/L米諾環素；MLCP抑制劑組在氧糖剝奪1 h前預先加入1 nmol/L MLCP抑制劑，余同米諾環素組。

1.5CCK-8法檢測細胞活性 參照CCK-8試劑盒說明書，復氧24 h后，每組每孔均加入10 μL的CCK-8試劑，放入37 ℃孵箱中繼續培養4 h，選擇490 nm波長，然后在酶標儀上檢測96孔板中各孔的吸光度值[OD490]，每組6個復孔，重復3次實驗，按公式計算PC12細胞的存活率=[實驗組平均OD490/正常組平均OD490]×100%。

1.6免疫細胞熒光 復氧24 h后，從24孔板中取出長有細胞的蓋玻片，PBS洗滌3次后，室溫下用4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次后滴加0.3% Triton X-100 37 ℃下破膜20 min，PBS漂洗后加10%山羊血清置于37 ℃恒溫箱封閉45 min，去除血清后加入兔抗MAP2抗體(1∶100)于4 ℃恒溫箱孵育過夜，對照組用PBS代替一抗，PBS漂洗后加入Dylight 594標記山羊抗兔抗體(1∶150)37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗后加入4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染5 min，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，在200倍熒光顯微鏡下隨機選取10個視野，實驗重復3次，采用Image-Proplus軟件對熒光圖像進行分析，計算PC12細胞神經突的平均長度。

1.7Western blot 參照凱基全蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白并測定樣品蛋白濃度，以1∶4加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5 min。每孔加入100 μg蛋白樣品進行電泳分離(12% SDS-PAGE，60 V、45 min，80 V、90 min)后轉膜(PDVF膜，250 mA、40 min)，分別加入一抗MLC(1∶1 000)，p-MLC(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日加入二抗(1∶3 000)孵育后ECL顯影并拍照，用Quantity One軟件對條帶進行分析，以目的與內參條帶光密度的比值作為蛋白表達的相對含量。

2 結 果

2.1米諾環素對OGD/R損傷的PC12細胞的保護作用 復氧24 h后，模型組PC12細胞的存活率為(48.6±3.2)%，米諾環素(1 μmol/L)處理后能夠明顯提高氧糖剝奪/復氧后PC12細胞的存活率[(77.7±3.3)%,P<0.05,圖1]，而米諾環素對正常培養PC12細胞的存活率無影響(P>0.05)。

2.2米諾環素對GAP-43蛋白表達的影響 在正常組PC12細胞中加入米諾環素后GAP-43蛋白無明顯改變，米諾環素并不會促進正常PC12細胞GAP-43的表達，也對正常PC12細胞無毒性作用；MC組GAP-43蛋白的表達(1.69±0.22)較模型組明顯升高(P<0.05)；而Gal組GAP-43蛋白的表達明顯低于MC組(0.32±0.13vs.1.69±0.22，P<0.05)，見圖2。

#：P<0.05，與正常組比較;★：P<0.05，與模型組比較

圖1米諾環素對PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷后的保護作用

1:正常組;2:模型組;3:MC組;4:Cal組;5:正常+MC組

圖2米諾環素對氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞GAP-43蛋白表達的影響

2.3米諾環素促進PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷后神經突生長 熒光顯微鏡下觀察可見正常組PC12細胞呈梭形，細胞兩極各有一個長突起(圖3)。模型組神經突平均長度為(15.75±5.92)μm，MC組為(44.79±5.36)μm，Cal組為(25.33±5.39)μm，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。

A:正常組；B:模型組；C:MC組；D:Cal組

圖3米諾環素對氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞神經突生長的影響(×200)

2.4米諾環素對PC12細胞OGD/R損傷后MLC磷酸化的影響 正常組PC12細胞中p-MLC蛋白僅有少量表達(0.21±0.06)；模型組p-MLC的表達顯著增加(1.02±0.12)，經米諾環素處理后，PC12細胞p-MLC的表達較模型組明顯下降(0.33±0.07)，差異有統計學意義(P<0.05)；預先加入抑制劑Calyculin A的PC12細胞， p-MLC的表達較MC組明顯增加(1.38±0.09，P<0.05)。各組間MLC蛋白的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

1：正常組；2：模型組；3：MC組；4：Cal組

圖4米諾環素對氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞MLC磷酸化的影響

3 討 論

缺血缺氧性腦損傷可造成不同程度的神經功能缺損，而神經功能的恢復與神經元的修復及軸突再生密切相關，促進軸突再生、神經元網絡重建以及突觸環路的形成是目前研究的熱點，也成為神經康復的首要目標。PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷真實地反映了缺血性腦卒中引起的腦損害。

米諾環素是一種高脂溶性的四環素類抗生素，它具有抗菌和抗炎活性并被臨床實踐證實為一種治療粉刺和關節炎的有效藥物。米諾環素能有效的通過血腦屏障從而在顱腦創傷、卒中、脊髓損傷、神經退行性疾病如肌萎縮性側索硬化、帕金森病、亨廷頓病及多發性硬化等疾病的動物模型中發揮神經保護作用[6-7]。近年來多項體外研究表明米諾環素對PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷具有一定的保護作用[8-9]，本研究前期的研究結果顯示，100 nmol/L至10 μmol/L米諾環素能提高氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞的存活率，其中1 μmol/L米諾環素對PC12細胞的保護作用最佳。因此本試驗選取該濃度的米諾環素用于后續神經突生長的研究。

RhoA/ROCK信號途徑是調節神經元軸突再生的主要信號通路，其下游底物之一肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)是重要的細胞骨架蛋白之一，相對分子質量為20×103，其表達與突觸再生密切相關。細胞內的MLC磷酸化水平對調節突出再生起到重要作用，在肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)雙重調節下，MLC發生磷酸化和去磷酸化的相互轉化。既往研究證實，Calyculin A可通過抑制MLCP阻斷神經生長因子(NGF)對PC12細胞神經突生長的促進作用[10]。生長相關蛋白-43(GAP-43)是一種表達在軸突末梢的突出前蛋白，與神經系統發育、突觸形成和神經再生有著密切關系，已經被證實在神經細胞受損之后的軸突再生過程中表達明顯增高，且在促進神經突生長和突出重塑中起到至關重要的作用[11-12]，可通過觀察其表達水平，了解軸突再生情況。

本研究發現，氧糖剝奪/復氧可誘導PC12細胞凋亡，降低其存活率，并通過上調p-MLC，誘導神經突回縮或抑制軸突再生。復氧24 h后，MC組較模型組PC12細胞存活率明顯增高，說明米諾環素可緩解PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷。模型組較正常組p-MLC水平明顯增高，而MC組較模型組p-MLC有明顯下降趨勢，且細胞存活率、GAP-43的表達及軸突長度測定較模型組均有明顯增高，說明米諾環素可能通過調節MLCP/MLC信號通路，調節細胞內MLC的磷酸化水平，進而緩解氧糖剝奪/復氧對PC12細胞的損傷作用并促進軸突再生。模型組較MC組p-MLC表達明顯增高，GAP-43表達明顯減少，且神經突長度明顯縮短，說明Calyculin A可能阻斷了米諾環素與MLCP/MLC信號通路的相互作用。因此，筆者認為MLCP/MLC信號通路可能與米諾環素促進PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷后神經軸突再生密切相關。

綜上所述，本研究發現1 μmol/L米諾環素對PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷具有保護作用，可明顯提高損傷細胞的存活率，顯著促進缺血缺氧/復氧之后神經突的生長，其機制可能為米諾環素促進受損的PC12細胞中MLCP/MLC信號通路激活，使得 MLC磷酸化水平降低，同時促進GAP-43表達增加，進而促進軸突再生及突觸網絡的重建。本研究發現，米諾環素對氧糖剝奪/復氧損傷的PC12細胞神經突生長的促進作用與MLCP/MLC信號通路的激活密切相關，揭示了米諾環素促進PC12細胞神經突生長潛在的細胞和分子機制，為將來的臨床應用提供了理論基礎。未來的研究可進一步探索MLCP/MLC信號通路激活靶點，為新型藥物的研究提供理論依據。