紫鉚因抑制脂多糖誘導小膠質細胞炎性反應的作用機制研究*

付 媛，楊浩池，陸 睿，陳明會，李劍星，呂 婕，劉亦恒，張海英△

(1.廣東醫科大學人體解剖學教研室，廣東東莞 523808;2.海南醫學院人體解剖學教研室，海口 571101; 3.海南省海口市人民醫院骨科中心 570208)

小膠質細胞是位于中樞神經系統內的固有的巨噬細胞樣免疫效應細胞，同時也是腦內神經炎癥調節過程中的主要效應細胞[1-2]。但當小膠質細胞被異常激活，長期處于過度活化狀態時，可以產生大量的炎癥介質和炎癥因子，引起慢性炎性反應，損傷神經元，使神經元退化、變性甚至死亡[3]。漆樹科植物漆樹(rhus verniciflua stokes)皮中含有豐富的黃酮類物質，其活性成分有紫鉚因。研究發現，紫鉚因具有抗氧化、抗炎癥、誘導腫瘤細胞凋亡等多種藥理作用[4]。因此，本研究擬用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為誘導激活劑，用 BV2細胞系作為小膠質細胞的體外模型細胞，建立體外神經炎癥模型，探討紫鉚因對LPS誘導小膠質細胞活化引起炎性反應的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 BV2小鼠小膠質細胞系購自中國科學院昆明細胞庫；紫鉚因、脂多糖、MTT購自Sigma公司； TRIzol Reagent 購自Life Invitrogen 公司； Taq SYBR Green qPCR Premix購自Nova公司； HRP山羊抗小鼠IgG、HRP驢抗兔IgG購自Thermo公司；Cy3 山羊抗兔IgG購自Millipore公司；β-actin小鼠單克隆抗體購自Sigma公司；p44/42 MAPK(ERK1/2)兔單克隆抗體、Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)兔單克隆抗體、MEK1/2兔單克隆抗體、Phospho-MEK1/2兔單克隆抗體、Phospho-c-Raf兔單克隆抗體、NF-κB p65兔單克隆抗體購自Cell Signalling公司；Raf-1兔單克隆抗體購于Abcam公司；Lamin B 兔多克隆抗體購于Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 BV2小膠質細胞使用含10%胎牛血清和1%的青鏈霉素的RPMI 1640 培養基，培養于25 cm2的細胞瓶中，置37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。實驗分為正常組：BV2細胞正常培養，不添加任何干預因素；模型組：LPS(10 μg/mL)誘導BV2小膠質細胞活化；實驗組：紫鉚因(1、10、30 μg/mL)預處理2 h后，與LPS(10 μg/mL)共培養。培養24 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2MTT法檢測紫鉚因對小膠質細胞存活率的影響 取對數生長期的正常BV2細胞，以1×105個/mL密度接種于96孔板，培養過夜后換無血清培養基進行加藥處理，加入不同濃度紫鉚因(0、1、10、30、50、100 μg/mL)繼續培養，每組設6個復孔，24 h后進行MTT實驗，檢測細胞存活率，實驗重復3次。

1.2.3qPCR法檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達變化 根據實驗分組收集細胞按TRIzol說明書提取RNA，檢測所提RNA純度及完整性，根據HiFi-MMLV cDNA Kit說明書進行反轉錄反應合成cDNA，根據Taq SYBR Green qPCR Premix進行qPCR反應，觀察炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達，引物于NCBI網站設計，并經過比對，由上海生工公司合成，具體序列見表1；反應參數為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火15s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，以GAPDH為內參擴增目的基因，用2-△△Ct方法進行相對定量分析，實驗重復3次。

1.2.4Western blot檢測NF-κB p65、ERK信號通路相關蛋白的表達 根據實驗分組收集細胞，根據細胞核蛋白和漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白和胞漿蛋白，用RAPI裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度后，取30 μL上樣經SDS-PAGE電泳后轉移到NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，β-actin(1∶5 000)，p-ERK(1∶2 000)、ERK、MEK、p-MEK、Raf、p-Raf、NF-κB p65均(1∶1 000)4 ℃搖床低速孵育過夜；加入 HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫輕搖孵育1 h，于凝膠成像儀中顯影拍照，以β-actin作為內參確定組間目標蛋白表達的差異和變化,實驗重復3次。

表1 qPCR引物序列

1.2.5免疫熒光法檢測紫鉚因對 NF-κB p65核轉移的影響 將各組細胞接種于小圓片上， 處理結束后4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min；5%驢血清+0.1% Triton封閉、打孔、通透90 min； NF-κB p65(1∶400)4 ℃搖床低速孵育過夜；加入cy3山羊抗兔熒光二抗(1∶200)，37 ℃孵育1 h；加入DAPI復染細胞核5 min；取出小圓片，事先于載玻片上滴加抗熒光淬滅劑，于正置熒光顯微鏡下觀察、成像,實驗重復3次。

2 結 果

2.1LPS誘導BV2小膠質細胞活化細胞模型建立 參照文獻[5-6]中采用的LPS劑量，本實驗中選用LPS濃度為10 μg/mL干預正常BV2小膠質細胞，并且預實驗結果顯示用LPS 10 μg/mL干預正常BV2細胞24 h后，對細胞存活率無明顯影響。

2.2MTT法檢測紫鉚因對BV2小膠質細胞存活率的影響 與正常組相比，各濃度的紫鉚因對BV2細胞存活率均無明顯影響，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 紫鉚因對BV2細胞存活率的影響(n=3)

2.3qPCR檢測紫鉚因對LPS誘導BV2小膠質細胞活化后炎癥因子mRNA表達的影響 與正常組比較，模型組細胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平明顯上調；而實驗組添加紫鉚因預處理后，IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達顯著下調，并呈濃度依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.4免疫熒光觀察紫鉚因對LPS誘導BV2小膠質細胞活化后NF-κB p65核轉移的影響 正常組細胞中NF-κB p65主要在胞質表達，核內幾乎看不到其熒光表達；模型組細胞中NF-κB p65被激活，NF-κB p65從胞質轉移至核內；而實驗組細胞結果顯示，紫鉚因能明顯抑制NF-κB p65的激活并下調其轉錄活性，阻止NF-κB p65向核內轉移，見圖3。

#：P<0.05，與正常組比較；*：P<0.05，與模型組比較

圖2紫鉚因對LPS誘導BV2小膠質細胞活化后炎癥因子mRNA表達的影響(n=3)

2.5Western blot檢測紫鉚因對LPS誘導 BV2小膠質細胞活化后NF-κB p65蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，正常組細胞中NF-κB p65蛋白主要在胞質中表達，細胞核內不表達或表達量很低；模型組細胞內NF-κB p65蛋白發生明顯的核轉移，由胞質轉移至核內，表現為胞質內NF-κB p65蛋白表達明顯降低，核內NF-κB p65蛋白表達明顯升高；而實驗組添加紫鉚因預處理后，NF-κB p65在核內表達降低，胞質內表達升高，并呈一定的濃度依賴性，見圖4。

圖4 紫鉚因對LPS誘導 BV2小膠質細胞活化后NF-κB p65蛋白表達的影響(n=3)

2.6Western blot檢測紫鉚因對LPS誘導 BV2小膠質細胞活化后ERK信號通路相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與正常組相比，模型組細胞在LPS誘導BV2小膠質細胞活化后，細胞內ERK信號通路蛋白的磷酸化水平明顯上調，p-MEK、p-ERK蛋白表達水平顯著升高，但是p-Raf表達無明顯變化。實驗組添加紫鉚因預處理后，能明顯抑制細胞內p-MEK、p-ERK蛋白表達增強，對p-Raf表達依然無明顯作用，Raf、MEK、ERK的表達均無變化，見圖5。

圖5 紫鉚因對LPS誘導 BV2小膠質細胞活化后ERK信號通路相關蛋白表達的影響(n=3)

3 討 論

小膠質細胞是腦內主要的免疫效應細胞，對中樞神經系統穩態的改變非常敏感，很容易受外界刺激而激活，小膠質細胞一旦被激活，誘發一系列的慢性炎性反應，釋放大量炎癥介質、促炎因子和神經毒素，產生過量的氧自由基和亞硝基復合物，長期炎性刺激，導致神經元的突觸功能障礙，促使神經元死亡，加速神經退行性疾病的發生發展[7-8]。因此，針對存在慢性神經炎癥損傷的中樞神經退行性疾病的治療中，比如是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，抑制小膠質細胞的異常激活或許具有潛在的臨床應用前景。紫鉚因是一種黃酮類化合物，是漆樹科植物漆樹皮的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎癥、抗癌等多種生物活性[4]。近來的研究表明，紫鉚因對谷氨酸誘導的神經毒性具有抑制作用，可以降低氧化應激及減少氧自由基的產生[9]；有研究證實，紫鉚因對大鼠急性脊髓損傷模型具有保護作用，但其抗炎作用機制尚不明確。本實驗中MTT結果顯示，紫鉚因本身對細胞活力無明顯影響，說明紫鉚因對小膠質細胞無細胞毒性。在LPS激活小膠質細胞后，細胞內IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達明顯升高，而紫鉚因干預后，可以顯著降低以上炎癥因子的表達，說明紫鉚因可以抑制小膠質細胞的活化，減少炎癥因子的產生。進而，對紫鉚因抑制小膠質活化的可能作用機制進行初步探討。結果發現，LPS活化小膠質細胞后，NF-κB p65被激活，從胞質轉移至核內，并且ERK信號通路相關蛋白p-MEK、p-ERK水平升高。紫鉚因干預后，明顯逆轉NF-κB p65的核轉移，下調p-MEK、p-ERK的表達，進而減輕炎性反應。由此推斷，紫鉚因的抗炎作用可能與ERK信號通路相關蛋白的調控有關。

神經炎癥的病理過程與炎癥因子和炎癥介質的產生密切相關，NF-κB(核轉錄因子κB)和MAPK家族(包括JNK，p38和ERK)在其中起到了關鍵的調節作用[10]。NF-κB是一種在細胞及組織內廣泛存的轉錄因子，是多種信號轉導途徑的交叉點，并且是細胞凋亡、增殖及分化的關鍵位點，參與多種相關基因的轉錄調控[11]。NF-κB廣泛存在于膠質細胞系，屬于NF-κB/Rel蛋白家族中的一員，最常見形式是由多肽鏈P50和P65 2個亞基組成的異源二聚體。細胞處于靜息狀態時，NF-κB位于胞質中，與抑制蛋白(IκB)單體結合組成復合物，呈非活性形式。當細胞受到外界各種信號刺激時，NF-κB被激活，從復合物結構中游離出來，并移位至細胞核，啟動基因轉錄[12-13]。炎癥基因的表達正是受NF-κB的轉錄調控[14]。本實驗結果顯示，正常組細胞中NF-κB p65主要在胞質內表達；模型組由于炎癥因子的刺激，NF-κB p65被激活，由胞質轉移至核內，而添加紫鉚因預處理抑制NF-κB p65的激活，降低它的轉錄活性，阻止其向核內轉移，進而下調炎癥因子的表達，抑制炎性反應，從而阻止炎性反應對神經元的損傷。MAPKs信號通路是細胞內最重要的信號通路之一，廣泛參與細胞的生長、增殖、分化、凋亡等過程。ERK是其中一條途徑，Raf、MEK都是ERK的上游分子。正常情況下，細胞中的Raf/MEK/ERK均以非磷酸化的形式存在，呈無活性狀態；當受外界刺激時，Raf/MEK/ERK蛋白發生磷酸化，呈功能活性狀態，啟動相關細胞因子和炎性介質的基因表達[15-16]。本實驗結果顯示，模型組細胞中p-MEK、p-ERK蛋白表達均明顯升高，呈活性功能狀態，而添加紫鉚因預處理可以顯著逆轉這一現象，并呈一定的濃度依賴性。說明紫鉚因抑制小膠質細胞活化的作用機制可能與調節ERK 信號通路相關蛋白的表達有關。

綜上所述，紫鉚因可以抑制小膠質細胞的激活，通過下調炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達從而減輕炎性反應，其作用機制可能與紫鉚因下調NF-κB p65的轉錄活性和抑制ERK信號通路相關蛋白的表達有關。本實驗通過這一系列的離體實驗為紫鉚因可能具有抑制慢性神經炎癥發展的這一作用，提供了一定的理論依據，也為后續的在體試驗打下了堅實的基礎。