CTLA4Ig與IDO基因共轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠肝移植后免疫耐受的影響*

唐茂明，徐雪松，賴 星，吳涯昆△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科 400010;2.重慶市萬州區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽外科 404100)

肝移植是對(duì)于終末期肝臟疾病較有效的治療方法。盡管肝移植術(shù)后免疫排斥的發(fā)生率及程度都遠(yuǎn)低于其他實(shí)質(zhì)器官，但是術(shù)后排斥反應(yīng)依然是影響術(shù)后遠(yuǎn)期生存率的主要因素[1-3]。

早期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4球蛋白(CTLA4Ig)對(duì)CD28的B分子有著高親和性，該蛋白能夠在心臟、肝臟、腎臟及胰島組織引起滿意的免疫耐受[4-5]。吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是一種IFN-γ誘導(dǎo)酶在移植術(shù)后排斥反應(yīng)的進(jìn)程中起著重要的作用[6]。但單獨(dú)轉(zhuǎn)染IDO基因未能達(dá)到有效的免疫耐受效果[7]。因此，本試驗(yàn)將探討CTLA4Ig4-IDO基因共轉(zhuǎn)染在大鼠肝移植術(shù)后免疫耐受中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 以BN大鼠[(215±35)g]分別作為供體和受體。所有大鼠均由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。pWBP-CTLA4Ig-IDO腺病毒、pWBP-CTLAIg4腺病毒、pWBP-IDO腺病毒均由上海吉瑪公司合成，選擇的干擾載體為ADV15(puro/EF1α/IRES-GFP)，病毒滴度為3×108TU/mL。受體大鼠分為4組：(1)CTLA4Ig-IDO組(n=10)，在肝移植冷缺血期，夾閉肝上靜脈及肝下靜脈后，按1×1011/mL的濃度，向供體肝臟經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)染1 mL pWBP-CTLA4Ig-IDO腺病毒(福能基因公司)；(2)CTLA4Ig組(n=10)，轉(zhuǎn)染pWBP-CTLAIg4腺病毒1 mL；(3)IDO組(n=10)，轉(zhuǎn)染pWBP-IDO組腺病毒1 mL；(4)對(duì)照組(n=10)，轉(zhuǎn)染空載病毒1 mL。在術(shù)后14 d處死5只大鼠，提取腔靜脈血液以及肝臟組織。剩余5大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)并用于生存率分析。全部大鼠均未出現(xiàn)手術(shù)操作不當(dāng)、術(shù)后出血以及感染等并發(fā)癥。對(duì)于未存活至14 d的大鼠，也提取其腔靜脈血液及肝臟組織。

1.2肝移植模型的構(gòu)建 按照改進(jìn)的Kamada方法進(jìn)行大鼠原位肝移植[8]。在肝移植中，將肝上靜脈和門靜脈以袖套法連接并將肝前靜脈縫合，將支架插入共同膽管進(jìn)行膽管重建，冷缺血時(shí)間小于60 min。

1.3組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)分析 處死受體大鼠后，將提取的供體肝臟以10%甲醛固定，石蠟包埋并以蘇木素-伊紅法染色。根據(jù)組織病理學(xué)結(jié)果，以Banff法對(duì)肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)進(jìn)行分度[9]。排斥反應(yīng)活性指數(shù)(rejection activity index,RAI)根據(jù)3項(xiàng)獨(dú)立評(píng)分進(jìn)行計(jì)算：靜脈內(nèi)皮炎癥、膽管損傷以及門靜脈炎癥。運(yùn)用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色法進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)其結(jié)果，檢測(cè)供體肝臟組織中CTLAIg4-IDO基因的表達(dá)情況。

1.4肝移植術(shù)后肝功能評(píng)價(jià) 運(yùn)用全自動(dòng)生化儀(Beckman)檢測(cè)大鼠靜脈血血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及總膽紅素(TBIL)水平。

1.5RT-PCR 以TRIzol法提取肝組織mRNA后，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，引物由福能基因公司合成。具體步驟如下：94 ℃變性60 s，58 ℃退火69 s，72 ℃延長60 s，72 ℃最終延長7 min為1個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。利用瓊脂糖凝膠電泳法分離PCR產(chǎn)物，同時(shí)以β-actin的相對(duì)光密度作為內(nèi)參，利用溴乙錠染色、明膠成像以及圖像分析系統(tǒng)對(duì)各細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行觀察以及半定量計(jì)數(shù)。

1.6Western blot 利用RIPA法于冰上提取總蛋白。提取出的蛋白按照4∶1的比例加入負(fù)載緩沖液,混合后煮沸5 min,處理后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后，在4 ℃環(huán)境下，利用聚偏氟乙烯(PVDF)薄膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜后，室溫下用洗膜緩沖液(TBST)清洗PVDF膜60 min。洗膜后，將PVDF膜浸泡于按1∶2 000稀釋后的辣根鈷氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠CTLA4Ig、IDO抗體溶液中，在4 ℃環(huán)境中孵育過夜。

1.7T細(xì)胞凋亡水平檢測(cè) Annexin V-FITC雙標(biāo)法進(jìn)行T細(xì)胞凋亡檢測(cè)。采用EDTA-free膜蛋白酶(Carlsbad,USA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化后離心，離心后加入PBS重懸。向懸液中加入500 μL膜連蛋白V結(jié)合懸浮細(xì)胞，再加入5 μL細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸異硫氰酸熒光素(Annexin-FITC)，將懸液充分混合均勻。向混合均勻的懸液中加入5 μL碘化丙啶后，在室溫避光條件下進(jìn)行染色反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為60 min。反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1受體生存率 所有大鼠在肝移植術(shù)后均未對(duì)飲食進(jìn)行特殊限制。對(duì)照組大鼠于術(shù)后第5天起出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)綜合征，包括：乏力、厭食、活動(dòng)能力下降、進(jìn)行性體質(zhì)量下降及總膽紅素水平持續(xù)增高等；對(duì)照組大鼠于術(shù)后第10天全部死亡。在CTLA4Ig-IDO組中，急性排斥反應(yīng)出現(xiàn)得更晚并且程度更輕。與對(duì)照組相比，CTLA4Ig-IDO組中急性排斥反應(yīng)綜合征的發(fā)生率顯著下降并且平均生存時(shí)間顯著提高(P<0.01)。CTLA4Ig組與IDO組各項(xiàng)指標(biāo)之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與對(duì)照組相比均存在顯著差異(圖1)。對(duì)照組大鼠均于10 d內(nèi)死亡，而CTLA4Ig-IDO組、CTLA4Ig組以及IDO組大鼠的生存率分別為80%、20%、20%(P<0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠生存率比較

組別移植物失去功能急性肝衰竭 膽管梗阻CTLA4Ig-IDO組0 0 1IDO組 1 1 2CTLA4Ig組0 2 2對(duì)照組2 30

2.2組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)分析 術(shù)后14 d處死各組大鼠，提取肝臟組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析。對(duì)照組出現(xiàn)典型的嚴(yán)重急性排斥反應(yīng)，例如：匯管區(qū)大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤；廣泛的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；水泡樣性；局部肝細(xì)胞壞死及膽管上皮損傷(圖2A)。在CTLA4Ig-IDO組中，絕大部分肝臟組織表現(xiàn)為正常組織結(jié)構(gòu)，僅存在少部分匯管區(qū)及肝小葉區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(圖2B)。CTLA4Ig-IDO組的排斥反應(yīng)程度顯著低于對(duì)照組。CTLA4Ig組及IDO組的排斥反應(yīng)程度均較CTLA4Ig-IDO組嚴(yán)重，但均較對(duì)照組輕微(圖2C、2D)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，經(jīng)門靜脈灌注CTLA4Ig-IDO腺病毒后，CTLA4Ig、IDO基因的表達(dá)在CTLA4Ig-IDO組中均為陽性，而在對(duì)照組中均為陰性。

A：對(duì)照組;B:CTLA4Ig-IDO組;C:CTLA4Ig組;D:IDO組

圖2各組大鼠供體肝臟組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)

2.3血清肝功能標(biāo)志物 到術(shù)后14 d為止，CTLA4Ig-IDO組中血清ALT、AST、TBIL水平均顯著低于其余3組(P<0.01)。CTLA4Ig組與IDO組比較，上述各項(xiàng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖3。

*：P<0.01，與其余3組比較；*：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖3各組大鼠供體肝臟肝功能血清標(biāo)志物水平

2.4蛋白及mRNA表達(dá) 到術(shù)后14 d為止，對(duì)照組中IFN-γ及IL-2的mRNA水平顯著高于其余3組(P<0.05)，CTLA4Ig-IDO組中IFN-γ及IL-2水平明顯低于其余3組(P<0.05)。CTLA4Ig-IDO組中IL-4、IL-10、TGF-β的mRNA水平明顯高于對(duì)照組中的上述細(xì)胞因子mRNA水平(P<0.05)，在CTLA4Ig組及IDO組之間，各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平不存在明顯差異(P>0.05)。Western blot顯示各組蛋白表達(dá)水平的差異趨勢(shì)與各組mRNA水平表達(dá)的差異趨勢(shì)相一致。對(duì)照組中TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯高于CTLA4Ig-IDO組，見圖4。

*：P<0.01，與其余3組比較；*：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖4各組大鼠供體肝臟細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5T淋巴細(xì)胞凋亡水平 CTLA4Ig-IDO組外周T細(xì)胞凋亡程度(35.57%)顯著高于其余3組(P<0.05)。在CTLA4Ig組(20.84%)、IDO組(22.75%)之間并不存在明顯差異(P>0.05)，但與對(duì)照組(14.63%)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

近年來，經(jīng)腺病毒基因轉(zhuǎn)染減輕移植物排斥反應(yīng)的方法受到了廣泛關(guān)注。CTLA4Ig含有一個(gè)細(xì)胞外CTLA4結(jié)構(gòu)域及IgG1結(jié)構(gòu)域，對(duì)B7-1分子高度親和，能夠阻斷APC與抗原特異性T細(xì)胞之間的共刺激因子信號(hào)通路[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，以腺病毒為載體，經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)染CTLA4Ig基因能夠在肝臟移植物中穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)，從而阻滯移植物中免疫活性細(xì)胞活性，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的凋亡、排斥反應(yīng)的降低、移植術(shù)后免疫耐受的形成[4,12]。因此，筆者認(rèn)為CTLA4Ig對(duì)于移植術(shù)后免疫耐受的形成有著重要作用[13-14]。

IDO參與了色氨酸代謝的調(diào)節(jié)并在APC中更加顯著。有研究提出，IDO在免疫相關(guān)性應(yīng)答中起著重要作用，包括移植相關(guān)免疫、腫瘤相關(guān)免疫、自身免疫性疾病及艾滋病感染等[15-16]。對(duì)于其機(jī)制，有以下2種推測(cè):(1)局部色氨酸耗竭抑制多種細(xì)胞的生長、分化；(2)色氨酸代謝抑制外周效應(yīng)T細(xì)胞并使其凋亡[17]。研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸能夠減輕移植后排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受的形成。ROBERT等[18]發(fā)現(xiàn)，CTLA4Ig引起實(shí)質(zhì)器官移植后免疫耐受形成主要與IDO代謝相關(guān)。亦有研究認(rèn)為，IDO對(duì)于減輕急性排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受方面無重要作用并在急性排斥反應(yīng)的過程中被上調(diào)[19]。這可能是因?yàn)榕懦夥磻?yīng)程度過重或者IDO沒有達(dá)到有效的活性水平。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者構(gòu)建了CTLA4Ig-IDO腺病毒、CTLA4Ig腺病毒及IDO腺病毒，經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)染至供體肝臟，將IDO、CTLA4Ig基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染與CTLA4Ig-IDO共轉(zhuǎn)染的效果進(jìn)行了對(duì)比。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，CTLA4Ig-IDO組供體肝臟大部分表現(xiàn)為正常肝組織結(jié)構(gòu)，僅有少部分門靜脈區(qū)和肝小葉區(qū)呈現(xiàn)出T淋巴細(xì)胞浸潤。對(duì)照組受體肝組織表現(xiàn)為典型急性排斥反應(yīng)，CTLA4Ig組、IDO組介于兩組之間。該結(jié)果表明，CTLA4Ig-IDO組對(duì)于移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的抑制作用最為顯著。

T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子有不同的免疫耐受調(diào)節(jié)作用，以IL-4、IL-10為代表的Th2型細(xì)胞因子能促進(jìn)免疫耐受的形成，以IL-2、IFN-γ為代表的Th1型細(xì)胞因子能抑制免疫耐受的形成[20]。對(duì)照組中IFN-γ、IL-2的mRNA表達(dá)水平明顯高于其余3組，CTLA4Ig-IDO組中顯著低于其余3組。CTLA4Ig-IDO組中IL-4、IL-10及TGF-β的mRNA表達(dá)水平明顯高于其余3組，對(duì)照組中明顯低于其余3組。這表明細(xì)胞因子mRNA水平與移植后排斥反應(yīng)的過程密切相關(guān)。各組T淋巴細(xì)胞凋亡指數(shù)以及受體生存率之間的差異也符合上述趨勢(shì)。

綜上所述，聯(lián)合轉(zhuǎn)染CTLA4Ig-IDO基因有著相互促進(jìn)的效應(yīng)，即在減少炎癥細(xì)胞浸潤、促進(jìn)細(xì)胞因子表達(dá)向Th2型方向偏移、誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡及改善移植術(shù)后生肝功能等方面有著更顯著的效果。